BRD4抑制劑JQ1對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖與凋亡的作用及其機(jī)制研究

譚益帆，劉修恒，王 磊，杜 洋，陳志遠(yuǎn)，劉 洋，沈 浩，刁長(zhǎng)會(huì)

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430060)

膀胱癌是泌尿系常見(jiàn)的惡性腫瘤，2017年美國(guó)新發(fā)膀胱癌患者數(shù)達(dá)79 030例，占所有新發(fā)癌癥患者的4.6%。因膀胱癌死亡患者達(dá)16 870例，占所有因癌癥死亡患者的2.8%[1]。在我國(guó)，膀胱癌是最常見(jiàn)的泌尿系腫瘤，其發(fā)病率及死亡率雖然低于美國(guó)等發(fā)達(dá)國(guó)家，但近年來(lái)也呈上升趨勢(shì)[2]。膀胱癌的病理學(xué)類型有很多種，主要包括尿路上皮癌、鱗狀細(xì)胞癌、腺癌以及小細(xì)胞癌等，其中最為常見(jiàn)的為尿路上皮癌[3]。膀胱癌的發(fā)病機(jī)制目前仍然不明確，涉及的生物學(xué)過(guò)程非常復(fù)雜，包括眾多基因突變、染色質(zhì)重組、激酶信號(hào)通路的改變等[4]。膀胱癌給人們帶來(lái)了巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，威脅到人類健康，因此不斷加深膀胱癌發(fā)病機(jī)制的認(rèn)識(shí)，并尋找一種行之有效治療方式已成為當(dāng)務(wù)之急。

布羅莫結(jié)構(gòu)域(bromodomains，BRDs)是一組包含110個(gè)氨基酸的蛋白分子，通過(guò)其特殊結(jié)構(gòu)可以識(shí)別組蛋白末端乙?；馁嚢彼嵛稽c(diǎn)。到目前為止已報(bào)道的溴結(jié)構(gòu)域蛋白有61種，根據(jù)結(jié)構(gòu)及功能的特點(diǎn)劃分為8大BRD蛋白家族，溴結(jié)構(gòu)域和超末端結(jié)構(gòu)(bromodomain and extraterminal domain，BET)家族作為BRD家族中一員包含BRD2、BRD3、BRD4及BRDT蛋白[5]。BD1和BD2是BET蛋白家族氮末端都包含的2種保守的溴結(jié)構(gòu)域，正是BD1和BD2這2種結(jié)構(gòu)域起著識(shí)別并結(jié)合組蛋白尾部賴氨酸的作用[6]。溴化結(jié)構(gòu)蛋白4(bromodomain-containing protein 4，BRD4)通過(guò)與組蛋白末端乙酰化賴氨酸結(jié)合可以促使染色質(zhì)重塑因子和轉(zhuǎn)錄因子等相關(guān)蛋白富集于特定的基因轉(zhuǎn)錄位點(diǎn)，改變RNA聚合酶Ⅱ的活性，調(diào)控基因的表達(dá)，參與一系列重要生物活動(dòng)過(guò)程，如細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞周期、炎癥等[7-9]。BET蛋白家族的致癌功能首次在睪丸核蛋白中線癌中證實(shí)，通過(guò)染色質(zhì)移位使BRD4基因突變，BRD4與睪丸核蛋白結(jié)合形成致癌蛋白，導(dǎo)致惡性睪丸核蛋白中線癌的發(fā)生[10]。隨后很多的研究證實(shí)，BRD4在肝癌、乳腺癌、肺癌、及結(jié)直腸癌等腫瘤組織及癌細(xì)胞中高表達(dá)，而癌旁正常組織中低表達(dá)，并且BRD4通過(guò)抑制促凋亡基因BIM的表達(dá)及促進(jìn)下游癌基因C-MYC的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[11-14]。

到目前為止多種BET蛋白家族小分子抑制劑已被報(bào)道，包括JQ1與I-BET762等。與所有的BET抑制劑一樣，JQ1可以競(jìng)爭(zhēng)性地與BRD4溴結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，使BRD4蛋白從染色質(zhì)的乙酰化賴氨酸上置換下來(lái)，從而干擾BRD4在機(jī)體中發(fā)揮生物學(xué)作用[15-16]。在與多種癌癥細(xì)胞的研究中表明，JQ1都能有效抑制BET溴結(jié)構(gòu)域，從而產(chǎn)生顯著的抗癌作用[17]。眾多文獻(xiàn)證實(shí)JQ1在治療膀胱癌具有廣闊的應(yīng)用前景。本文旨在探討JQ1對(duì)膀胱癌細(xì)胞的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞與材料人膀胱癌細(xì)胞株EJ細(xì)胞購(gòu)于上海生命科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶購(gòu)于美國(guó)Gibco公司；JQ1購(gòu)于Selleck，用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后，配成溶度為50 mmol/L的儲(chǔ)存濃度，儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱；CCK8試劑盒(cell counting kit-8)購(gòu)于于同仁化工上海雙達(dá)生物有限公司；磷脂結(jié)合蛋白-異硫氰酸熒光素/碘化丙啶(annexin V-fluorescein isothiocyanate/propidium iodide，Annexin V-FITC /PI)凋亡試劑盒、PI周期試劑盒購(gòu)于聯(lián)科公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)于TaKaRa公司。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 膀胱癌細(xì)胞株EJ細(xì)胞用含10%的胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，置于含5%、37 ℃的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。2～3 d換液傳代1次，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2CCK8法檢測(cè)JQ1對(duì)膀胱癌細(xì)胞株的活性影響 待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)70%～80%時(shí)，用0.25%胰酶消化下細(xì)胞并進(jìn)行計(jì)數(shù)，離心細(xì)胞重新加入培養(yǎng)基，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×103個(gè)/100 μL，以每孔100 μL將細(xì)胞接種于96孔板中。待24 h后細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)基，分別加入不同濃度的 JQ1，處理24、48、72 h，并設(shè)立不加藥物只加細(xì)胞及培養(yǎng)基的對(duì)照組及只加藥物和培養(yǎng)基的空白對(duì)照組。棄去培養(yǎng)基，每孔加入含100 μL培養(yǎng)基和10 μL的CCK8試劑，2 h后用酶標(biāo)儀測(cè)，于450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值(A值)。JQ1對(duì)細(xì)胞存活率的影響(%)=[(實(shí)驗(yàn)孔A值-空白孔A值)/(對(duì)照孔A值-空白孔A值)]，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次(實(shí)驗(yàn)孔含JQ1、細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK8試劑；對(duì)照孔含細(xì)胞、培養(yǎng)基、CCK8試劑；空白孔含培養(yǎng)基、CCK8試劑)。

1.2.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 EJ細(xì)胞分為3組，DMSO組、JQ1(0.5 μmol/L)組、JQ1(1 μmol/L)組。細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)70%～80%，加入DMSO、0.5、1 μmol/L的JQ1，48 h后收集各組細(xì)胞懸液，細(xì)胞懸液經(jīng)預(yù)冷的磷酸鹽(phosphate buffered solution,PBS)緩沖液洗滌2遍，加入250 μL 結(jié)合液(Binding Buffer)重懸細(xì)胞，調(diào)整其濃度為1×106個(gè)/ mL。取100 μL的細(xì)胞懸液于5 mL流式管中，加入5 μL Annexin V-FITC和10 μL的PI溶液。混勻后室溫避光孵育15 min，最后在反應(yīng)管中加入400 μL PBS，流式細(xì)胞儀分析，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期 EJ細(xì)胞分為3組，DMSO組、JQ1(0.5 μmol/L)組、JQ1(1 μmol/L)組。細(xì)胞接種于6孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)70～80%，加入0.5、1 μmol/L的JQ1，48 h后0.25%胰酶消化并收集各組細(xì)胞懸液，加入70%的乙醇溶液4 mL過(guò)夜，之后PBS緩沖液洗滌細(xì)胞，加入PI溶液和RNaseA(核糖核酸酶)室溫避光孵育30 min，流式細(xì)胞儀分析，并用modfit LT2.0軟件分析細(xì)胞周期，上述實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.2.5Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JQ1對(duì)膀胱癌EJ細(xì)胞侵襲作用影響 EJ細(xì)胞接種在6孔板，完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，分別加入含JQ1與DMSO的繼續(xù)培養(yǎng)48 h，每個(gè)小室加入80 μL的基質(zhì)膠。之后胰蛋白酶消化細(xì)胞，以細(xì)胞數(shù)量1×105個(gè)/100 μL接種于小室，下室加入500 μL含10%血清培養(yǎng)基，24 h后，使用0.5%結(jié)晶紫染色。倒置顯微鏡觀察并拍照穿膜的細(xì)胞。

1.2.6qRT-PCR法檢測(cè)JQ1對(duì)EJ細(xì)胞C-MYC及Bcl-XL基因表達(dá)的影響 EJ細(xì)胞接種于6 孔板，待細(xì)胞生長(zhǎng)融合度達(dá)70%～80%，加入DMSO、0.5、1 μmol/L的JQ1，48 h后，分別加入Trizol試劑提取RNA。用紫外線分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度和純度。將提取的總RNA取等量按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用實(shí)時(shí)定量熒光PCR儀(美國(guó)ABI公司)按照試劑盒說(shuō)明書(shū)以cDNA為模板，使用C-MYC及Bcl-Xl的特定引物(上海生工生物有限公司合成)，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，以GAPDH為內(nèi)參。依據(jù)各組循環(huán)閾值Ct采用2-△△ct結(jié)果作為測(cè)定mRNA的相對(duì)表達(dá)量。所有引物均參照相關(guān)文獻(xiàn)設(shè)計(jì)，由Invitrogen公司合成。序列如下：C-MYC，上游5′-AGGGATCGCGCTGAGTATAA-3′和下游5′-TGCCTCTCGCTGGAATTACT-3′；Bcl-2，上游5′-AGTACCTGAACCGGCACCT-3′和下游5′CAGCCAGGAGAAATCAAACAG-3′；GAPDH，上游5′-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′和下游5′-CGTCAAAGGTGGAGGAGTG-3′。

2 結(jié) 果

2.1JQ1抑制EJ細(xì)胞株的增殖JQ1抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，我們首先分別采用濃度為0.0032、0.016、0.08、0.4、2、10 μmol/L的JQ1處理膀胱癌EJ細(xì)胞，72 h后加入CCK8試劑，2 h后用酶標(biāo)儀，于450 nm波長(zhǎng)處讀取吸光度值(A值)，計(jì)算各組的增殖率，得出JQ1在EJ細(xì)胞株的IC50值為0.79 μmol/L(圖1A)。因此，之后的實(shí)驗(yàn)我們選取JQ1濃度為0.5、1 μmol/L進(jìn)行。JQ1對(duì)EJ細(xì)胞的活性有明顯的抑制作用，在濃度為0.5～1 μmol/L之間，隨作用時(shí)間延長(zhǎng)細(xì)胞活性逐漸降低(圖1B)。因此,JQ1可呈時(shí)間和濃度依賴的方式抑制膀胱癌EJ細(xì)胞的增殖。

圖1BRD4抑制劑JQ1抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖

A：JQ1的濃度分別為0.0032、0.016、0.08、0.4、2、10 μmol/L處理膀胱癌EJ細(xì)胞后細(xì)胞存活率；B：濃度為0.5、1 μmol/L的JQ1處理EJ細(xì)胞24、48、72 h后細(xì)胞存活率；與對(duì)照組比較，*P<0.05(n=3)。

2.2JQ1促進(jìn)EJ細(xì)胞株凋亡JQ1促進(jìn)EJ的凋亡，我們采用了JQ1濃度為0.5、1 μmol/L處理EJ細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀分析周期，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比，經(jīng)JQ1處理過(guò)的EJ細(xì)胞株凋亡細(xì)胞明顯增多，且隨濃度增加而逐漸增多。差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2A、B)。

圖2BRD4抑制劑JQ1誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞凋亡

A：濃度為0.5、1 μmol/L的JQ1處理EJ細(xì)胞48 h后通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡；B：濃度為0.5、1 μmol/L的JQ1處理EJ細(xì)胞48 h后計(jì)算細(xì)胞凋亡的百分比；與對(duì)照組比較：*P<0.05(n=3)。

2.3JQ1阻滯EJ細(xì)胞株于G0/G1期為了驗(yàn)證JQ1對(duì)EJ細(xì)胞周期的影響，我們采用JQ1濃度為0.5、1 μmol/L處理EJ細(xì)胞，48 h后收集細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀分析周期，結(jié)果(圖3A、B)顯示與對(duì)照組相比，JQ1處理過(guò)的EJ細(xì)胞株G0/G1期細(xì)胞比例明顯增多，且隨濃度增加而增多，提示JQ1阻滯細(xì)胞于G0/G1期，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖3BRD4抑制劑JQ1阻滯膀胱癌細(xì)胞于G0/G1期

A：濃度為0.5、1 μmol/L的JQ1處理EJ細(xì)胞48 h后通過(guò)流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞周期；B：濃度為0.5、1 μmol/L的JQ1處理EJ細(xì)胞48 h后計(jì)算細(xì)胞所處周期的百分比數(shù)；與對(duì)照組比較，*P<0.05(n=3)。

2.4JQ1抑制EJ細(xì)胞株侵襲驗(yàn)證JQ1是否對(duì)膀胱癌細(xì)胞的侵襲能力有影響，我們采用濃度為0.5、1 μmol/L的JQ1處理EJ細(xì)胞株，對(duì)照組采用DMSO處理，結(jié)果顯示JQ1對(duì)EJ細(xì)胞的侵襲能力產(chǎn)生顯著的抑制作用(圖4)。

圖4BRD4抑制劑JQ1降低膀胱癌細(xì)胞侵襲能力

2.5JQ1下調(diào)EJ細(xì)胞株中C-MYC及Bcl-2mRNA表達(dá)量分別用濃度為0.5 μmol/L、1 μmol/L的JQ1處理EJ細(xì)胞株，48 h后提取總RNA并用qRT-PCR法檢測(cè)JQ1對(duì)C-MYC及Bcl-2表達(dá)量的影響。結(jié)果顯示經(jīng)JQ1處理后的EJ細(xì)胞C-MYC及Bcl-2表達(dá)量下降，并且隨著JQ1濃度的增加mRNA表達(dá)量逐漸下降(圖5)。

圖5BRD4抑制劑JQ1下調(diào)EJ細(xì)胞株中C-MYC及Bcl-2mRNA表達(dá)量

A：C-MYC mRNA相對(duì)表達(dá)量；B：Bcl-2 mRNA相對(duì)表達(dá)量；與對(duì)照組比較，*P<0.05(n=3)。

3 討 論

膀胱癌是一種異質(zhì)性的腫瘤,在男性中高發(fā)，是造成男性因癌癥死亡的第4大原因，研究證實(shí)大量飲酒及吸煙是膀胱癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)因素[18]。其治療方式選擇取決于腫瘤的病理分期和分級(jí)，對(duì)于早期非肌層浸潤(rùn)的膀胱癌主要采取原發(fā)腫瘤切除術(shù)或者聯(lián)合膀胱灌注化療藥物，而對(duì)于肌層浸潤(rùn)膀胱癌主要采取根治性膀胱切除術(shù)，隨著新輔助全身化療以及放療的聯(lián)合應(yīng)用患者預(yù)后有明顯改善[19]。然而膀胱癌有著很高的復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移率，目前對(duì)于復(fù)發(fā)性及轉(zhuǎn)移性膀胱癌缺乏有效的治療方法，因此開(kāi)發(fā)出一種新的治療方法尤為重要。許多文獻(xiàn)證實(shí)BRD4抑制劑JQ1可以抑制腫瘤的發(fā)生發(fā)展，提示JQ1可能會(huì)成為膀胱癌的新治療手段。

近年來(lái)，表觀遺傳調(diào)控逐漸成為腫瘤研究的熱點(diǎn)，腫瘤存在表觀遺傳調(diào)控異常逐漸得到證實(shí)。針對(duì)表觀遺傳調(diào)控藥物已在臨床實(shí)驗(yàn)應(yīng)用并且非常有前景[20-21]。BET家族作為表觀遺傳識(shí)別蛋白通過(guò)結(jié)合組蛋白尾部賴氨酸，調(diào)控基因的表達(dá)，參與細(xì)胞周期、細(xì)胞生長(zhǎng)、凋亡、炎癥等一系列重要生物活動(dòng)過(guò)程，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。JQ1作為第一種BET蛋白家族抑制劑，在多種腫瘤中證實(shí)其可以與BRD4溴結(jié)構(gòu)域相結(jié)合，使BRD4蛋白從染色質(zhì)的乙酰化賴氨酸上置換下來(lái)，從而干擾BET蛋白發(fā)揮生物學(xué)作用。另外在體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中都證實(shí)JQ1還可以通過(guò)C-MYC依賴途徑和非C-MYC依賴途徑產(chǎn)生抗腫瘤效應(yīng)[22]。在我們的研究中，通過(guò)設(shè)立不同濃度JQ1組作用于膀胱癌細(xì)胞，我們發(fā)現(xiàn)隨著濃度的增加，JQ1逐漸抑制膀胱癌細(xì)胞的增殖，隨后延長(zhǎng)作用時(shí)間，膀胱癌細(xì)胞的活性逐漸降低，證實(shí)JQ1可呈時(shí)間和濃度依賴的方式抑制膀胱癌細(xì)胞增殖。接著我們通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)JQ1對(duì)膀胱癌的作用，結(jié)果顯示JQ1通過(guò)促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞于G0/G1期產(chǎn)生抗癌作用。

BET蛋白抑制劑抗癌效應(yīng)的具體機(jī)制尚未完全揭示，目前較為明確的機(jī)制是JQ1可以調(diào)節(jié)C-MYC的表達(dá)。C-MYC影響著許多細(xì)胞生物學(xué)功能，包括細(xì)胞增殖、凋亡等。C-MYC表達(dá)的下調(diào)導(dǎo)致細(xì)胞增殖受到抑制，甚至誘導(dǎo)抗凋亡基因如Bcl-XL和Bcl-2表達(dá)的降低從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡增多[23-24]。然而在有些腫瘤細(xì)胞中，JQ1通過(guò)非C-MYC途徑產(chǎn)生抗癌效應(yīng)[25]。我們通過(guò)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)證實(shí)，JQ1通過(guò)作用C-MYC及Bcl-2達(dá)到抗癌的效應(yīng)。隨著JQ1濃度的增加，癌基因C-MYC及抗凋亡基因Bcl-2表達(dá)逐漸下降，提示JQ1在膀胱癌中抗癌效應(yīng)可能與C-MYC及Bcl-2基因表達(dá)減少有關(guān)。

綜上所述，BRD4抑制劑JQ1抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞于G0/G1期，其可能機(jī)制與降低癌基因C-MYC及抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)有關(guān)。我們研究結(jié)果可能對(duì)未來(lái)膀胱癌治療提供了一種新的思路。

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