無籽沙糖桔E3泛素連接酶U-box基因的克隆及表達(dá)分析

唐文武，莫燦坤，吳秀蘭

(肇慶學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，廣東 肇慶 526061)

植物自交不親和性是部分顯花植物為促進(jìn)異花授粉，防止近親繁殖而形成的一種遺傳機(jī)制，它涉及高等植物受精過程中雌蕊和花粉之間的相互作用，是研究細(xì)胞間相互識別、信號傳遞及基因時空表達(dá)的一種理想模型。根據(jù)其遺傳機(jī)制可分為配子體、孢子體自交不親和兩種類型，其中配子體自交不親和現(xiàn)象在薔薇科、玄參科、茄科等植物中較常見，其自交不親和反應(yīng)主要由花粉F-box和花柱中的S-RNase等基因控制[1-2]。泛素/26S蛋白酶體途徑是真核生物最重要的蛋白降解途徑，參與調(diào)控了80%～85%的蛋白質(zhì)降解過程[3]。泛素/26S途徑主要由泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3和26S蛋白酶體組成[4]，它們會共同作用引起S-RNase等特異蛋白的泛素化并降解，從而影響花粉萌發(fā)和花粉管的生長延伸，導(dǎo)致自交不親和的發(fā)生[5]。因此，泛素/26S蛋白酶體途徑在植物的自交不親和中發(fā)揮著重要作用。

泛素連接酶E3在底物蛋白特異性識別中起到關(guān)鍵作用，根據(jù)其共價鍵結(jié)合方式，可分為HECT、RING-finger和U-box結(jié)構(gòu)域等3種類型[6]。U-box域是植物特有的一類高度保守的功能結(jié)構(gòu)域，由70多個氨基酸殘基構(gòu)成，在細(xì)胞發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和光周期反應(yīng)等反面具有重要生理功能。在擬南芥和蕓薹屬植物中包含U-box域的ARC1和ARM蛋白在自交不親和反應(yīng)中發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[7-8]。無籽沙糖桔是沙糖桔芽變材料中選育出的自交不親和品種，在生產(chǎn)和科學(xué)研究中具有重要價值[9]。苗紅霞等[10-11]通過SSH技術(shù)從無籽沙糖桔材料中獲得一些與泛素/26S蛋白酶體途徑相關(guān)的非S因子，并篩選到1個含U-box域的EST序列在子房中高表達(dá)。本研究以此為基礎(chǔ)，利用無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔為試材，分離克隆了沙糖桔U-box基因的cDNA全長序列，并對其DNA與蛋白質(zhì)序列、表達(dá)特性、同源進(jìn)化關(guān)系等開展研究，為研究該基因在柑橘自交不親和反應(yīng)中的作用及選育奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的各類沙糖桔材料種植于肇慶市四會果園8 a生果樹，于春季盛花期分別對無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔的葉、芽、花絲、花粉、雌蕊、柱頭、子房、花柱進(jìn)行取樣，并獲取無籽沙糖桔自交授粉、異花授粉(無籽沙糖桔×有籽沙糖桔)后不同發(fā)育時期的雌蕊。以上材料摘取后利用液氮速凍后帶回實(shí)驗(yàn)室，貯藏在-80 ℃冰箱中備用。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 總RNA的提取及cDNA合成 總RNA提取按照北京天恩澤的Column Plant RNAout試劑盒說明步驟操作，經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測質(zhì)量，再利用紫外分光光度儀測定RNA含量。cDNA第一鏈合成利用M-MLV試劑盒(Life Technology公司)及說明方法進(jìn)行，DNase I 和RNase 抑制劑購于TAKARA公司。

1.2.2CrU-box基因克隆及生物信息學(xué)分析 以SSH文庫中篩選出的無籽沙糖桔EST序列為基礎(chǔ)[11]，參照甜橙基因組(http://citrus.hzau.edu.cn)中登錄號為Cs6g21870的U-box基因序列，設(shè)計(jì)1對引物U-box-F/R(表1)擴(kuò)增沙糖桔U-box基因的cDNA，其25 μL PCR反應(yīng)體系為模板cDNA 1μL，10×PCR buffer 2.5 μL，引物各0.5 μL，dNTP 1.0 μL，ExTaq0.25 μL，補(bǔ)ddH2O至25 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94 ℃ 5 min；30個循環(huán)包括94 ℃ 45 s，55 ℃ 45 s，70 ℃ 90 s；最后72 ℃再延伸10 min。然后利用TAKARA公司生產(chǎn)的瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，連接到克隆載體pMD19-T vector，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，通過PCR及酶切鑒定的陽性克隆送華大基因公司測序。利用SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)對CrU-box基因編碼蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，利用 BLAST工具對CrU-box蛋白進(jìn)行比對搜索，下載其它植物同源U-box蛋白序列，利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3CrU-box基因的實(shí)時熒光定量PCR分析 提取無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔葉、芽、花絲、花粉、雌蕊、柱頭、子房、花柱等不同組織器官的總RNA，以及無籽沙糖桔自交授粉、異交授粉(無籽沙糖桔×有籽沙糖桔)后9個不同時段(0,12,24,48,72,96,120,144,168 h)的雌蕊總RNA，并反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。設(shè)計(jì)特異性引物qU-box-F/R(表1)以及柑橘actin為內(nèi)參引物(表1)，利用TARAKA公司的SYBR Premix ExTaqII熒光染料試劑盒，TOYOBO 公司生產(chǎn)的7300 Real-time PCR擴(kuò)增儀進(jìn)行實(shí)時熒光定量PCR。具體實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格按照SYBR Premix ExTaqII說明書進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后采用2-ΔΔCT法[12]進(jìn)行結(jié)果分析，計(jì)算出CrU-box基因相對表達(dá)量，并繪制柱形分析圖，統(tǒng)計(jì)分析采用one-way ANOVA法，n=3。

表1 相關(guān)引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 CrU-box基因克隆

提取無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔的總RNA，經(jīng)12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示28S、18S RNA的條帶清晰明亮(圖1A)，且A280/A260值介于1.80～2.0，A260/A230值大于2.0，表明提取的總RNA較完整且無DNA污染。利用U-box-F/R引物擴(kuò)增無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔的雌蕊cDNA，結(jié)果見圖1B。由圖可知，該特異性PCR引物在無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔中均擴(kuò)增獲得一條清晰的條帶，其長度約3 000 bp。

A:總RNA提??；B：PCR擴(kuò)增結(jié)果；1：無籽沙糖桔；2：普通有籽沙糖桔A:Total RNA;B:Production of PCR;1:Wuzishatangju;2:Putongyouzishatangju圖1 沙糖桔RNA提取及PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 RNA extraction and PCR products of U-box gene in Shatangju

2.2 無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔的CrU-box基因序列分析

將上述PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)回收后克隆并測序，DNA測序結(jié)果及蛋白序列見圖2、圖3。由圖2可知CrU-box基因的ORF長度為3 150 bp，預(yù)測編碼1 049 aa的蛋白質(zhì)。無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔在ORF區(qū)域存在4個bp的差異，分別為第837位的G變?yōu)锳、1 215位的C變?yōu)門、1 837位的A變?yōu)門、1 868位的C變?yōu)镚，并導(dǎo)致第279位的纈氨酸V變?yōu)楫惲涟彼酙、第612位的酪氨酸Y變?yōu)楸奖彼酕(圖3)。

WZSTJ為無籽沙糖桔的CrU-box序列；PTYZSTJ為普通有籽沙糖桔的CrU-box序列WZSTJ:CrU-box sequence of Wuzishatangju;PTYZSTJ:CrU-box sequence of Putongwuzishatangju圖2 無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔CrU-box基因部分序列比對Fig.2 comparison partial sequence of U-box gene between wuzishatangju and youzishatangju

圖3 無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔CrU-box蛋白部分氨基酸序列比對Fig.3 Comparison partial amino acid sequence of U-box protein between wuzishatangju and youzishatangju

2.3 CrU-box結(jié)構(gòu)域及系統(tǒng)進(jìn)化分析

利用SMART軟件對無籽沙糖桔、普通有籽沙糖桔的CrU-box基因編碼的蛋白進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)CrU-box蛋白的951～1 021位點(diǎn)存在1個U-box保守結(jié)構(gòu)域，該U-box域位于C端，主要修飾RING鋅指結(jié)構(gòu)，表明CrU-box屬于U-box家族成員之一。利用BLAST工具對CrU-box蛋白開展比對搜索，選取含U-box結(jié)構(gòu)域且相似性較高的11種植物U-box蛋白序列，與普通有籽沙糖桔和無籽沙糖桔的CrU-box蛋白進(jìn)行序列比對和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析，結(jié)果見圖4。蛋白序列比對結(jié)果顯示，12種含U-box結(jié)構(gòu)域的同源蛋白間序列相似性均較高(80.7%～99.6%)。其中沙糖桔和甜橙(C.sinensis)相似性最高，達(dá)到99.6%；其次與克里曼丁桔(C.clementina)相似性為99.2%；與黃瓜(C.sativus)序列差異最大，但相似性也達(dá)80.7%。該結(jié)果表明植物U-box蛋白在進(jìn)化過程中保守，進(jìn)化上柑橘屬植物聚為一類，而榴蓮(Duriozibethinus)、雷蒙德氏棉(Gossypiumraimondii)、煙草(Nicatianaattenuata)因同源性較高聚為一類，木薯(Manihotesculenta)、葡萄(Vitisvinifera)、蘋果(Malusdomestica)、桃(Prunuspersica)、核桃(Juglansregia)、黃瓜(Cucumissativus)聚為一類。

WZSTJ為無籽沙糖桔的CrU-box蛋白；PTYZSTJ為普通有籽沙糖桔的CrU-box蛋白WZSTJ：Protein of Cru-box from Wuzishatangju;PTYZSTJ:Protein of Cru-box from Putongyouzishatangju圖4 CrU-box與其它植物U-box蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic tree analysis of U-box protein in plant

2.4 CrU-box基因的時空表達(dá)量分析

CrU-box基因在無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔不同器官間的實(shí)時熒光定量PCR結(jié)果見圖5。由圖可知，CrU-box基因在無籽和普通有籽沙糖桔的7個不同組織器官均有表達(dá)，其中芽、葉、花瓣、花絲、柱頭和花柱表達(dá)量均較低，而子房表達(dá)量遠(yuǎn)高于其他器官表達(dá)量。在無籽沙糖桔中，CrU-box基因在子房中表達(dá)量是最低的花瓣表達(dá)量的12.5倍(P<0.01)；在普通有籽沙糖桔中，CrU-box基因在子房中表達(dá)量是最低花瓣表達(dá)量的10倍(P<0.01)。由此可知，CrU-box基因在無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔中均表現(xiàn)出在子房中高表達(dá)量特征。

由于CrU-box基因在子房中的高表達(dá)特征，為進(jìn)一步了解其在授粉后的表達(dá)量水平，本試驗(yàn)研究了自交授粉(無籽沙糖桔×無籽沙糖桔)、異交授粉(無籽沙糖桔×普通有籽沙糖桔)后CrU-box基因在雌蕊器官中不同時間段的表達(dá)水平，結(jié)果見圖6。由圖可知，CrU-box基因在自交授粉和異交授粉后的0～96 h表達(dá)量逐漸增加，96 h表達(dá)量達(dá)到最大值，96～168 h表達(dá)量逐漸下降。但在授粉后48，72，96 h時間段上，自交授粉的CrU-box基因相對表達(dá)量遠(yuǎn)高于異交授粉后的表達(dá)量；尤其是無籽沙糖桔自交授粉后的96 h表達(dá)量遠(yuǎn)高于異交授粉后96 h相對表達(dá)量，且自交授粉96h表達(dá)量是異交授粉的4.5倍(P<0.01)。因此，筆者初步推測無籽沙糖桔自交授粉后CrU-box基因的高表達(dá)水平，可能激活泛素分子，導(dǎo)致S-RNase等特異蛋白的泛素化及降解，從而引起花粉管的延伸受阻，導(dǎo)致自交不親和的發(fā)生。

圖5 CrU-box基因在無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔不同組織間的表達(dá)量Fig.5 Expression analyses of CrU-box gene in different tissues from Wuzishatangju and Putongshatangju by real-time PCR

自交授粉為無籽沙糖桔×無籽沙糖桔；異交授粉為無籽沙糖桔×有籽沙糖桔Self pollination(Wuzishatangju×Wuzishatangju);Cross pollination(Wuzishatangju×Putongyouzishatangju)圖6 CrU-box基因在自交授粉和異交授粉后不同時間段的表達(dá)量 Fig.6 Expression analys of the CrU-box gene in different stages after self-pollination and cross-pollination by real-time PCR

3 討論與結(jié)論

柑橘是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，無籽性是柑橘新品種選育的重要目標(biāo)，而自交不親和是柑橘無籽果實(shí)形成的主要因素。無籽沙糖桔是從廣東10 月橘的芽變材料中選育出的新品種，其屬于配子體自交不親和類型[9]。研究表明，配子體自交不親和反應(yīng)主要由花粉F-box和花柱中的S-RNase等基因控制[1-2]，其它如SKP1-like 蛋白[13]、SSK1互作蛋白[14]、Cullin 1[15]等非S因子也參與自交不親和反應(yīng)。泛素/26S蛋白酶體途徑作為最重要的蛋白降解途徑，在植物的自交不親和反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[3]。泛素激活酶E1、泛素結(jié)合酶E2、泛素連接酶E3等多種酶共同作用促進(jìn)自交不親和反應(yīng)中一些蛋白如S-RNase的泛素化并將其降解，從而抑制花粉管的生長與延伸。作為E3泛素連接酶重要成分的U-box蛋白，在細(xì)胞發(fā)育、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和光周期反應(yīng)等反面具有重要生理功能[16]。

為探明無籽沙糖桔自交不親和的分子機(jī)制，本研究以無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔為試材，克隆了無籽沙糖桔E3泛素連接酶CrU-box基因，并在無籽沙糖桔和普通有籽沙糖桔的ORF區(qū)域發(fā)現(xiàn)4個核苷酸的差異，并導(dǎo)致2個位點(diǎn)的氨基酸發(fā)生改變?；虮磉_(dá)分析顯示，CrU-box基因在子房中表達(dá)量最高，其授粉后0～96 h表達(dá)量逐漸增加，96 h表達(dá)量達(dá)到最大值，96～168 h表達(dá)量逐漸下降。但在授粉后48，72，96 h時間段上，自交授粉的CrU-box基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于異交授粉后的表達(dá)量。該結(jié)果與前人發(fā)現(xiàn)的無籽沙糖桔自交不親和發(fā)生的抑制部位在子房，自交授粉72 h花粉管開始向遠(yuǎn)離胚珠的子房底部生長，從而不能完成授粉的結(jié)果相一致[17]。在擬南芥中包含U-box/ARM結(jié)構(gòu)域的ARC1蛋白，是SRK激酶的下游信號因子。其自花授粉時，SRK會被SCR/SP11磷酸化，并引起ARC1蛋白磷酸化，并通過U-box結(jié)構(gòu)域與E2泛素結(jié)合酶相互作用，使得底物泛素化，進(jìn)而導(dǎo)致自交不親和反應(yīng)的發(fā)生[7]。本研究發(fā)現(xiàn)的無籽沙糖桔自交授粉后的48～96 h時期CrU-box基因表達(dá)量遠(yuǎn)高于異交授粉，因此筆者推測高特異表達(dá)的CrU-box蛋白可能與其它泛素分子結(jié)合，導(dǎo)致S-RNase等特異蛋白的泛素化及降解，從而引起花粉管延長受阻或向遠(yuǎn)離胚珠的子房底部生長，導(dǎo)致無法完成受精過程并形成自交不親和現(xiàn)象。但CrU-box蛋白作為非S因子，如何參與自交不親和性反應(yīng)過程仍需進(jìn)一步研究。

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