大鼠膿毒癥模型的凝血功能研究

李錦靈，黃樹武，李舸，劉書華，李韻峰，關雅倫，李雪嬌，黃韌，王暉，張鈺*

(1. 廣東藥科大學中藥學院，廣州 510006； 2. 廣東省實驗動物重點實驗室，廣東省實驗動物監(jiān)測所，廣州 510663； 3. 清遠職業(yè)技術學院，廣東清遠 511510)

膿毒癥是一種患病率逐漸增高且死亡率高的全身性疾病[1-2]，常由嚴重創(chuàng)傷、燒傷、大手術、感染等因素所誘發(fā)，臨床表現(xiàn)為發(fā)熱、低血壓、高乳酸血癥、凝血功能紊亂、過度的炎癥反應，隨著病情的發(fā)展易并發(fā)彌散性凝血功能障礙(disseminated intravascular coagulation, DIC)[3]，導致膿毒癥休克或多器官功能障礙(multiple organ dysfunction syndrome, MODS)[4-5]。Kinasewitz等[6]對2530例膿毒癥病人的薈萃分析結果表明，炎性反應和凝血系統(tǒng)的改變與疾病的嚴重程度和病死率密切相關。目前認為，凝血功能紊亂貫穿于膿毒癥的整個病理過程，是膿毒癥發(fā)生發(fā)展及預后的關鍵性因素[7]。近幾年，已有許多臨床報道膿毒癥與血小板、凝血四項、D-二聚體、抗凝血酶III、血栓彈力圖等凝血功能指標的相關性[8-11]。本研究通過大鼠膿毒癥模型，探討膿毒癥疾病狀態(tài)與凝血功能的動態(tài)變化，以及肺、腎、肝、脾的組織病理變化，進一步評價凝血功能指標變化與病情嚴重程度和預后判斷的關系，為膿毒癥大鼠模型的推廣應用和相關藥物篩選提供基礎數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠95只，8～10周齡，體重250～280 g，由中山大學實驗動物中心提供【SCXK(粵)2016-0029】。實驗大鼠飼養(yǎng)及大鼠膿毒癥模型建立及術后定時采血、處死、組織解剖在廣東省實驗動物監(jiān)測所屏障動物實驗設施內(nèi)進行【SYXK(粵)2012-0122】。所有操作均符合實驗動物倫理學要求(倫理審批號：IACUC2016028)。

1.1.2 儀器與材料

血細胞儀(Sysmex XT-200i型，日本)，全自動凝血儀(Stago Compact型，法國)，呼吸麻醉機(Matrx VIP型，美國)，生物顯微鏡(Leica DM2500，德國)，組織包埋機(Leica EG1150H+C，德國)，全自動輪轉切片機(Leica RM2255，德國)，異氟烷(深圳市瑞沃德生物科技有限公司，批號：217150301，中國)，鹽酸曲馬多注射液(德國格蘭泰有限公司，批號：01474E，德國)，抗凝血酶III測定試劑盒(Stago，法國)，D-二聚體檢測試劑盒(Stago，法國)，血管性血友病因子檢測試劑盒(Stago，法國)，血漿抗凝蛋白S檢測試劑盒(Stago，法國)，1 mL EDTA-K2抗凝管(廣州健福醫(yī)藥科技有限公司，中國)，2 mL枸櫞酸鈉1∶9血凝管(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司，中國)。

1.2 方法

1.2.1 模型建立與樣品采集

隨機取10只SD大鼠用于建模并統(tǒng)計生存率[12]，手術采用異氟烷呼吸麻醉，待大鼠麻醉后，剃去腹部被毛，75%酒精消毒大鼠腹部皮膚，沿腹中線位置剪開1～2 cm開口，分離表皮和肌層，找到盲腸，在盲腸長度1/2的位置用3號線結扎，結扎后使用8號針頭在盲腸盲端以上約0.5 cm處橫穿扎孔，用針頭來回貫穿兩次，將盲腸放回腹腔，盡量避免腸內(nèi)容物粘附在手術切口。逐層縫合肌肉層和皮膚。術后給予每只大鼠皮下注射1 mL生理鹽水配制的鹽酸曲馬多作為止痛劑，在手術后48 h內(nèi)每12 h注射一次。統(tǒng)計術后12 d大鼠的生存情況。另取75只隨機平均分成3組，以同樣方法建模后于術后8、16、48 h三個時間點，取存活的大鼠空腹狀態(tài)下進行腹主動脈采血，置枸櫞酸鈉1∶9血凝管和EDTA-K2抗凝管，混勻，立即送檢。剩余10只作為對照組(Sham組)，對照組除不進行盲腸結扎和穿孔外，其余操作同CLP手術組。

1.2.2 檢測指標及方法

按照試劑盒說明，使用全自動凝血儀檢測凝血四項：活化部分凝血活酶時間(activated partial thromboplastin time, APTT)，凝血酶原時間(prothrombin time, PT)，凝血酶時間(thrombin time, TT)，纖維蛋白原(fibrinogen, FIB)，以及凝血因子Ⅶ活性(factor VII:C)，凝血因子Ⅻ活性(factor XII:C)，抗凝血酶III(antithrombin-III, AT-III)，血管性血友病因子相關抗原(von Willebrand Factor antigen, vWF:Ag)，D-二聚體(D-dimer, D-D)，蛋白S抗原(protein S antigen, PS:Ag)，使用血細胞儀檢測血小板(platelet, PLT)數(shù)量。

1.2.3 組織病理學檢查

解剖48 h時CLP手術組和Sham組大鼠肝、肺、腎、脾組織，常規(guī)4%甲醛固定，脫水后石蠟包埋，切4 μm切片，HE常規(guī)染色，生物顯微鏡觀察各臟器組織病理學變化。

1.3 統(tǒng)計學分析

使用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，生存曲線采用Kaplan-Meier分析，對樣本組間比較采用t檢驗(P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義)，使用GraphPad Prism 6.0軟件作圖。

注：A：活化部分凝血活酶時間；B：凝血酶原時間；C：凝血酶時間；D：凝血因子VII活性；E：凝血因子XII活性；F：纖維蛋白原；CLP后8、16和48 h組與0 h組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖2 CLP手術組大鼠凝血功能指標的變化Note. A: APTT. B: PT. C: TT. D: Factor VII: C activity. E: Factor XII activity. F: FIB.After CLP, the 8, 16 and 48 h groups were compared with the 0 h group, respectively.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.Fig.2 Changes of coagulation function in rats of the CLP

2 結果

2.1 CLP手術組大鼠生存率

大鼠膿毒癥模型表現(xiàn)為急性發(fā)病特征，在觀察的12 d內(nèi)，動物于4 d內(nèi)出現(xiàn)大量死亡，生存率約30%(圖1)。兩組生存率差異有顯著性(P<0.001)。手術后大鼠精神萎靡，寒顫，氣促，行動遲緩，眼瞼部出現(xiàn)粘稠的分泌物，肛門處有糞便粘連，表現(xiàn)出對外界刺激反應淡漠，并于24 h內(nèi)開始死亡。Sham組大鼠精神狀態(tài)良好，行為覓食未表現(xiàn)異常。

注：Sham組與CLP手術組比較(n=10)，***P <0.001。圖1 CLP手術組與Sham組大鼠的生存曲線Note. Compared with the sham group and CLP group (n=10),***P<0.001.Fig.1 Survival curves of rats in the sham and CLP surgery groups

2.2 凝血功能指標結果

大鼠膿毒癥模型表現(xiàn)為凝血4項指標異常。如圖2所示，A-F中，在疾病發(fā)展的急性期48 h內(nèi)，相對于手術前，大鼠CLP手術組APTT時間從8 h開始逐漸延長一直延續(xù)到48 h(P<0.05)(圖2-A)，PT時間從16 h開始逐漸延長一直延續(xù)到48 h(P<0.05)(圖2-B)，TT時間于48 h才出現(xiàn)時間延長(P<0.01)(圖2-C)；同時XII:C和VII:C出現(xiàn)一過性被抑制(P<0.05)(圖2-D,E)。而且，F(xiàn)IB量從16 h出現(xiàn)明顯增多維持到48 h(P<0.001)(圖2-F)。

大鼠膿毒癥模型還顯示其他凝血功能相關指標的紊亂。如圖3所示，在疾病發(fā)展的急性期48 h內(nèi)，相對于手術前，CLP手術組大鼠與內(nèi)皮損傷有關的vWF:Ag數(shù)量于8 h明顯增多一直維持在較高水平(P<0.001)(圖3-G)；PLT數(shù)量從8 h開始出現(xiàn)明顯下降一直維持在下降水平(P<0.01)(圖3-H)，纖溶系統(tǒng)重要指標D-D量于16 h出現(xiàn)逐漸增多(P<0.05)(圖3-I)；與抗凝系統(tǒng)有關的PS:Ag量在48 h出現(xiàn)明顯下降(P<0.001)(圖3-J)；然而AT-III量卻未見明顯變化(圖3-K)。

2.3 組織病理學結果

與Sham組對比，CLP手術后48 h，部分肺泡腔擴張，肺泡隔斷裂，局部肺泡組織結構被破壞，肺泡腔數(shù)量減少。腎組織呈現(xiàn)退行性改變，腎小球出現(xiàn)萎縮。肝組織中肝竇出現(xiàn)擴張。脾組織中脾小體邊緣區(qū)出現(xiàn)增厚，細胞結構模糊。這些組織切片中都未見明顯的靜脈血栓和出血的組織病理特征。(圖4)

注：G：血管性血友病因子；H：血小板；I：D-二聚體；J：蛋白S抗原；K：抗凝血酶Ⅲ；CLP后8、16和48 h組與0 h組比較，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。圖3 CLP手術組大鼠凝血功能指標的變化Note. G: vWF:Ag. H: PLT. I: D-D. J: PS:Ag. K: AT-III.After CLP, the 8, 16 and 48 h groups were compared with the 0 h group, respectively.*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001.Fig.3 Changes of coagulatory function in rats of the CLP group(n=8,

圖4 大鼠肺、腎、肝、脾組織病理學變化(HE染色，×400)Fig.4 Histopathological changes of the rat lung, kidney, liver and spleen tissues

3 討論

姚詠明等[13]認為膿毒癥的發(fā)病機制與炎癥反應失衡、免疫功能紊亂、凝血功能異常以及神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡、線粒體損傷、內(nèi)質網(wǎng)應激、細胞自噬、基因多態(tài)性等多方面因素相關。本實驗采用經(jīng)典CLP技術制備大鼠膿毒癥模型，前期研究顯示，該模型發(fā)病急，死亡較高，短期內(nèi)血液中出現(xiàn)一過性炎癥因子增加及載菌量增加，表現(xiàn)出膿毒癥疾病特征[12]。

凝血系統(tǒng)激活作為膿毒癥的重要發(fā)病環(huán)節(jié)，與炎癥反應相互作用[14-16]，促進膿毒癥的病理生理過程[17]。目前認為，凝血功能紊亂可能包括3種機制：①凝血系統(tǒng)的激活，組織因子誘導凝血酶產(chǎn)生，血小板活化聚集；②生理性抗凝機制受損，如抗凝血酶系統(tǒng)、蛋白C系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor, TFPI)系統(tǒng)受損；③纖溶系統(tǒng)受抑，使纖維蛋白微栓的清除遲緩[13,18-19]。膿毒癥發(fā)生時，機體炎癥介質和抗炎介質之間的失衡，釋放多種機體炎性物質和細胞因子“瀑布樣”釋放，同時也導致了凝血功能的紊亂。研究證實，內(nèi)皮細胞損傷導致主要組織因子(tissue factor, TF)的異常表達[20]，后者與活化的VII形成復合物，啟動外源性凝血途徑。實驗結果中大鼠膿毒癥模型出現(xiàn)Ⅶ的活性被抑制，PT的時間延長，顯示此時外源性凝血途徑發(fā)生障礙。同時XII的活性也被抑制，相應的APTT時間延長，也顯示此時內(nèi)源性凝血途徑發(fā)生障礙。因此，大鼠膿毒癥模型在急性期48 h內(nèi)，內(nèi)外源凝血系統(tǒng)都存在障礙。其次，大鼠膿毒癥模型表現(xiàn)PLT明顯下降。王征等[21]以血小板計數(shù)下降的趨勢作為膿毒癥患者病情風險的判斷依據(jù)更有意義。受損的內(nèi)皮細胞釋放vWF促進血小板粘附和聚集，vWF水平是內(nèi)皮損傷的標志之一[22]。本研究中的膿毒癥模型也顯示vWF量的明顯升高。

凝血與抗凝在生理條件下需要維持穩(wěn)定的狀態(tài)，抗凝血系統(tǒng)激活阻止血液的凝固，包括抗凝血酶系統(tǒng)、蛋白C系統(tǒng)和組織因子途徑抑制物。PS作為蛋白C系統(tǒng)的重要組成成分，是一種維生素K依賴的抗凝因子，主要由肝分泌，是活化蛋白C的重要輔因子，正常情況下血漿中40%PS以游離形式存在，60%的PS與補體C4b調(diào)節(jié)蛋白形成復合物(C4b-binding protein, C4bBP)而無活性。而蛋白C的抗凝能力由PS的自由片斷加強，膿毒癥時C4bBP的血漿水平升高，引起游離PS相對不足，則機體抗凝能力下降[23]。大鼠膿毒癥模型早期顯示肝功能的損傷[24]，實驗中PS含量在48 h時出現(xiàn)顯著降低，可能是肝合成受損和消耗增加、游離形態(tài)的蛋白S水平下降和急性期C4b結合蛋白增加。然而，抗凝系統(tǒng)AT-Ⅲ在本模型中未發(fā)現(xiàn)明顯變化。

凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)在疾病過程中也需要維持穩(wěn)定狀態(tài)。FIB在凝血系統(tǒng)和纖溶系統(tǒng)中同時發(fā)揮著重要作用，是凝血過程中的主要蛋白質。FIB升高，血液處于高凝狀態(tài)，血流速度減慢，血液粘滯性增加，易于產(chǎn)生血栓，進一步加重微循環(huán)障礙[25]。大鼠膿毒癥模型FIB明顯增多，顯示機體此時發(fā)生高凝狀態(tài)，機體會試圖通過纖溶激活生成纖溶酶，纖溶酶可降解交聯(lián)纖維蛋白而形成一種特異性降解產(chǎn)物D-D，其水平的增高可反映機體的纖溶活性增強。本實驗結果中膿毒癥大鼠D-D出現(xiàn)明顯增多現(xiàn)象，可能存在繼發(fā)性纖溶亢進，產(chǎn)生大量纖維蛋白(原)降解產(chǎn)物(fibrin(ogen) degradation product, FDP)，干擾了纖維蛋白的聚合，于是TT在48 h時出現(xiàn)顯著延長。

研究證實，膿毒癥病情惡化時，會進一步引起心、肝、脾、肺、腎等多種臟器的損傷[26-28]，最終導致死亡。本實驗結果中，膿毒癥大鼠48 h組織病理診斷，可見到肝、脾、肺、腎均有不同程度的損傷，但是未發(fā)現(xiàn)凝血系統(tǒng)紊亂導致的靜脈血栓和出血特征。

綜上所述，本研究通過CLP手術誘導的膿毒癥大鼠模型表現(xiàn)為凝血功能紊亂：APTT、PT與TT延長，vWF含量升高，F(xiàn)IB增多，PLT下降，PS濃度在抗凝受損時下降及D-D纖溶時明顯增多。通過凝血功能指標水平的監(jiān)測，為膿毒癥動物模型的藥物篩選評價，輔助膿毒癥的病情判斷和預后提供參考數(shù)據(jù)。

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