DNA條形碼技術(shù)在陜西漢中地區(qū)管薊馬物種鑒定中的應(yīng)用

黨利紅， 高 植， 胡 楊

(陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院， 陜西 漢中 723000)

管薊馬是纓翅目Thysanoptera管尾亞目Tubulifera管薊馬科Phlaeothripidae物種的總稱，薊馬種類繁多，世界已知831屬6000余種，管薊馬世界已知2亞科457屬3566種[1]，管薊馬科是纓翅目中最大的一個(gè)科，在我國(guó)分布廣泛，包括79屬285種[2]。陜西省漢中地區(qū)是我國(guó)南北過(guò)渡地區(qū)，氣候潮濕，生態(tài)環(huán)境優(yōu)良，適宜生物生存，同時(shí)也是世界上物種多樣性最豐富的地區(qū)之一，該地區(qū)以種植水稻、玉米、油菜等經(jīng)濟(jì)作物為主，適宜的生存環(huán)境和良好的食源，為纓翅目昆蟲(chóng)提供了較好的繁殖生境。管薊馬為銼吸式口器，常銼破植物表皮組織吮吸汁液造成為害，危害性廣，是重要的農(nóng)業(yè)害蟲(chóng)之一[3]，阻礙農(nóng)作物葉、花、種子的正常生長(zhǎng)，嚴(yán)重威脅到農(nóng)作物產(chǎn)量而越來(lái)越受到人們重視[4]。

DNA條形碼(DNA Barcoding)是近幾年來(lái)國(guó)際生物學(xué)研究的熱點(diǎn)之一。DNA條形碼是依據(jù)較短的標(biāo)準(zhǔn)DNA序列進(jìn)行物種鑒定的方法[5]。DNA條形碼技術(shù)的出現(xiàn)可以更好更快地的鑒別物種，了解物種的分類地位和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[6]。DNA條形碼自提出以來(lái)，已在多個(gè)類群的研究中得到了應(yīng)用，包括真菌、植物、纖毛蟲(chóng)、珊瑚、腹足類、蜘蛛、甲殼動(dòng)物、昆蟲(chóng)、魚(yú)類、兩棲類、鳥(niǎo)類及靈長(zhǎng)類等。國(guó)內(nèi)也有一批學(xué)者開(kāi)展了相關(guān)研究，如屠云潔等[7]對(duì)3個(gè)地方雞的線粒體COI基因多樣性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明COI基因?qū)﹄u品種的鑒定結(jié)果與形態(tài)鑒定基本相符。馮毅等[8]用DNA條形碼信息研制DNA芯片，成功鑒定了3種西花薊馬。彭居俐等[9]的研究表明以COI基因作為鲌屬魚(yú)類DNA條形碼進(jìn)行物種鑒定具有一定的可行性。王中鐸等[10]探討了COI基因在硬骨魚(yú)類輔助物種鑒別的適用性。DNA條形碼為生物分類提供了一個(gè)快速、簡(jiǎn)便的鑒定系統(tǒng)。在一些生物多樣性調(diào)查研究中，DNA條形碼鑒定物種的準(zhǔn)確率達(dá)到了97%或97.9%。在鱗翅目等類群中，通過(guò)DNA條形碼發(fā)現(xiàn)了大量隱存種或新種。如朱丹丹和謝瑾[11]利用DNA條形碼技術(shù)鑒定了卷蛾科昆蟲(chóng)22種，發(fā)現(xiàn)了近緣種；楊瑞生等[12]通過(guò)DNA條形碼技術(shù)快速準(zhǔn)確地鑒定了鱗翅目11種害蟲(chóng)。在科技部基礎(chǔ)工作專項(xiàng)的支持下，我國(guó)DNA條形碼技術(shù)規(guī)范體系與信息系統(tǒng)已經(jīng)初步構(gòu)建，并在農(nóng)林害蟲(chóng)、藥用昆蟲(chóng)、媒介昆蟲(chóng)、傳粉昆蟲(chóng)、外來(lái)人侵物種、重要保護(hù)動(dòng)物等領(lǐng)域已有應(yīng)用。

對(duì)于薊馬而言，依賴形態(tài)特征的物種鑒定具有一定的局限性。由于薊馬體型微小，近似種之間的區(qū)別特征少且不明顯，對(duì)于薊馬的精準(zhǔn)防治不能起到指導(dǎo)性作用。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子鑒定為物種的鑒定提供了新的方法，可以檢測(cè)物種間及同種個(gè)體間的細(xì)微差別。DNA條形碼技術(shù)是最佳的手段，可方便快捷地確定薊馬的種類、特點(diǎn)、習(xí)性、生活史等重要信息，為薊馬的鑒定提供有效手段，這也是未來(lái)物種鑒定的發(fā)展趨勢(shì)。但是我國(guó)有關(guān)薊馬的分子系統(tǒng)學(xué)研究還很欠缺，正處于初期探索階段，僅涉及到DNA條形碼基礎(chǔ)數(shù)據(jù)的積累。因此，開(kāi)展該類群DNA條形碼研究來(lái)填補(bǔ)我國(guó)在該領(lǐng)域研究的匱乏，同時(shí)提供更多的管薊馬條形碼序列，為將來(lái)結(jié)合形態(tài)和分子數(shù)據(jù)深入探討我國(guó)管薊馬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究、農(nóng)作物害蟲(chóng)的生物防治提供可靠的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

本文通過(guò)對(duì)陜西省漢中地區(qū)管薊馬線粒體COI基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，探討管薊馬的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系；快速、準(zhǔn)確、高效地確定陜西地區(qū)管薊馬物種，為陜南地區(qū)農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的提高以及管薊馬的生物學(xué)防治提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。

1 材料、儀器與試劑

1.1 材 料

本研究所用薊馬標(biāo)本均為成蟲(chóng)，為充分研究陜西省漢中地區(qū)管薊馬的分布與危害，于2015—2017年分別在陜西理工大學(xué)北校區(qū)、漢臺(tái)區(qū)陜南植物園、城固縣周邊農(nóng)田、洋縣梨園及草壩村周邊農(nóng)田等地采集薊馬標(biāo)本，涉及的植物種類繁多，主要有小麥、油菜、蠶豆、蔥、三葉草及雜草等。

1.1.1 標(biāo)本的采集

薊馬種類繁多，生活環(huán)境復(fù)雜，寄主豐富，因此采集方法多樣。本研究主要運(yùn)用兩種采集方法：

1)掃捕法：對(duì)于生活在雜草叢中的管薊馬，通過(guò)用捕蟲(chóng)網(wǎng)在雜草種來(lái)回掃動(dòng)；

2)敲打法：最常用的薊馬采集方法，將一個(gè)白色托盤(pán)置于植物下，直接敲打植物的葉子、花、枯樹(shù)枝葉以及雜草等，使薊馬脫離寄主，掉在白盤(pán)上。

通過(guò)以上方法采得的薊馬，用小號(hào)毛筆直接刷入裝有體積分?jǐn)?shù)95%酒精的采集小管，詳細(xì)記錄每瓶薊馬樣品的采集信息，包括瓶號(hào)、體色、寄主植物、為害狀、數(shù)量、采集時(shí)間、地點(diǎn)以及采集人等。

1.1.2 標(biāo)本的保存

將采集到的薊馬標(biāo)本置于盛有體積分?jǐn)?shù)95%酒精的離心管中，-20 ℃保存，以備分子實(shí)驗(yàn)用。

1.2 儀 器

本實(shí)驗(yàn)所用儀器有：雙目解剖鏡、marker筆、鑷子、酒精燈、燒杯、剪刀、膠帶、濾紙、小毛筆、大頭針、離心管、移液槍、離心機(jī)、電子天平、XH-C旋轉(zhuǎn)混合器、水浴鍋、微波爐、電泳儀、高壓滅菌鍋、冰箱等。

1.3 試 劑

本實(shí)驗(yàn)用到的試劑包括：博日組織基因組試劑盒、蛋白酶K、DNA Lodding buffer、核酸染料、DNA marker、Taq mix、無(wú)水乙醇、超純水、TAE×50、瓊脂糖、引物L(fēng)CO1-1490和HCO1-2198。

2 實(shí)驗(yàn)步驟

2.1 實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備

實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前，準(zhǔn)備好薊馬標(biāo)本、酒精燈、離心管、解剖鏡、大頭針、小毛刷、鑷子、離心機(jī)、水浴鍋、混合儀等儀器，設(shè)置水浴鍋溫度為56 ℃，并等待水溫恒定。

2.2 薊馬DNA無(wú)損傷提取

2.2.1 消 化

(1)準(zhǔn)備1.5 mL的離心管數(shù)個(gè)(一頭薊馬一個(gè)離心管，離心管均需高溫蒸汽滅菌)放置于離心管支架臺(tái)上，分別加入180 μL的ATL Buffer，并用marker筆在離心管上標(biāo)出相應(yīng)的樣品編號(hào)；

(2)從所采集的薊馬標(biāo)本中選取不同地區(qū)、不同蟲(chóng)態(tài)、不同顏色、不同大小的完整薊馬標(biāo)本，用小毛筆輕輕放在吸水紙上，吸附體壁上酒精，再轉(zhuǎn)移到解剖鏡下，冷卻后，在薊馬腹部刺3～5針，以保證消化液與蟲(chóng)體組織充分接觸，再轉(zhuǎn)移到裝有ATL Buffer的離心管中，按順序編號(hào)(實(shí)驗(yàn)所涉及到薊馬種類信息見(jiàn)表1)；

(3)重復(fù)步驟2，直至所有管薊馬標(biāo)本處理完；

(4)向離心管中加入20 μL的Proteinase K(蛋白酶K)，用混合儀震蕩混勻，放入56 ℃水浴鍋中水浴18 h(或過(guò)夜)。

表1 本研究涉及的薊馬樣品信息

2.2.2 提 取

(1)將標(biāo)本從水浴鍋中取出，用移液槍將蟲(chóng)體從離心管中吸出放入蒸餾水中，編號(hào)，以備形態(tài)分類學(xué)鑒定；

(2)準(zhǔn)備1.5 mL的滅菌離心管和指形管，分別對(duì)應(yīng)編號(hào)；

(3)將消化好的離心管離心20 s，分別加入200 μL AL Buffer和200 μL無(wú)水乙醇(冰)，在混合儀上混合數(shù)秒；

(4)將離心管(含有DNA樣品的混合試劑)全部轉(zhuǎn)移到1.5 mL的指形管里，進(jìn)行離心，8000 rpm，1 min；

(5)棄掉原來(lái)的collection tube(即含有廢棄溶液的指形管)，再將具有DNA附著膜的柱子放入新的collection tube，分別加入500 μL的AW1 buffer，進(jìn)行離心，8000 rpm，1 min；

(6)同步驟(5)，棄掉原來(lái)的collection tube，再將具有DNA附著膜的柱子放入新的collection tube，分別加入500 μL的AW2 buffer，進(jìn)行離心，14 000 rpm，3 min；

(7)棄掉原來(lái)的collection tube然后將中間的柱子移入到之前準(zhǔn)備的1.5 mL的離心管里；

(8)加入25 μL的AE buffer，室內(nèi)靜置1 min，然后離心，8000 rpm，1 min；

(9)棄掉中間的柱子，得到DNA；

(10)將得到的DNA保存于-20 ℃冰箱中，準(zhǔn)備PCR。

2.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)為：LCO1-1490：GGTCAACAAATCATAAAGATATTG和HCO1-2198：TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA，由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成。

本實(shí)驗(yàn)采用30 μL擴(kuò)增體系，包含試劑有21 μL超純水，5.8 μL Taq mix，0.6 μL引物L(fēng)CO1-1490，0.6 μL HCO1-2198，2 μL DNA模板。主要步驟如下：

(1)將超純水、Taq mix、引物、DNA混入0.5 mL的離心管中；

(2)將離心管放在PCR儀中進(jìn)行擴(kuò)增；

(3)擴(kuò)增循環(huán)：94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃變性0.5 min，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，共40個(gè)循環(huán)，最后在72 ℃充分延伸10 min；

(4)將擴(kuò)增好的樣本放置于4 ℃下保存。并準(zhǔn)備電泳檢測(cè)。

2.4 電泳檢測(cè)

將擴(kuò)增出來(lái)的結(jié)果進(jìn)行電泳，檢測(cè)是否出現(xiàn)目的條帶，以便確定是否送樣檢測(cè)。電泳檢測(cè)主要步驟如下：

(1)制膠：將50×TAE稀釋為1×TAE，取50 mL 1×TAE和0.5 g瓊脂糖混溶，置于微波爐內(nèi)加熱1 min后取出加入10 μL核酸染料，充分混合倒入制膠板靜置，等待膠凝固；

(2)點(diǎn)樣：等膠凝固后，取PCR擴(kuò)增后的DNA混合液4 μL和Marker 4 μL點(diǎn)入膠孔；

(3)電泳：在90 V電壓下進(jìn)行電泳60 min；

(4)觀察：將點(diǎn)樣后的膠放置于紫外燈照射下，觀察是否出現(xiàn)目的條帶。

2.5 送樣檢測(cè)

將經(jīng)過(guò)電泳檢測(cè)成功的PCR產(chǎn)物原液送往北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行DNA測(cè)序，以獲得薊馬樣品的COI序列。

2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

將獲得的DNA條形碼序列運(yùn)用MEGA5.05進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，其中以薊馬科Thripidae的2屬2種為外群，管薊馬科Phlaeothripidae管薊馬亞科Phlaeothripinae的3屬5種作為內(nèi)群，完成系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建。

3 結(jié) 果

3.1 PCR擴(kuò)增

本次實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)PCR擴(kuò)增，得到的PCR產(chǎn)物原液進(jìn)行電泳檢測(cè)后，在紫外燈照射下，薊馬樣品的COI基因序列可在接近600 bp處檢測(cè)出有明顯亮帶，經(jīng)過(guò)實(shí)驗(yàn)研究，共成功獲得18條COI基因序列。

3.2 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建

對(duì)已獲得18條COI序列進(jìn)行編輯、拼接，應(yīng)用軟件MEGA5.05使用最大簡(jiǎn)約樹(shù)法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果共得5屬7種，如圖1所示。

3.2.1 系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果

圖1中，薊馬COI基因分別聚為四個(gè)分支，第一支為主分支，由3個(gè)物種構(gòu)成，經(jīng)憑證標(biāo)本的形態(tài)學(xué)鑒定為豆簡(jiǎn)管薊馬(Haplothripskurdjumovi)、華簡(jiǎn)管薊馬(Haplothripschinensis)和稻管薊馬(Haplothripsaculeatus)，此3種均屬于管尾亞目、管薊馬科、簡(jiǎn)管薊馬屬，系統(tǒng)發(fā)育分析其聚為一支；第二、三、四支：有四條序列支持，分屬于滑管薊馬屬Liothripssp.、器管薊馬屬Hoplothripssp.和薊馬科物種，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果其分為3個(gè)獨(dú)立的分支。

3.2.2 結(jié)果分析

第一支：從形態(tài)學(xué)特征上分析，豆簡(jiǎn)管薊馬和華簡(jiǎn)管薊馬的區(qū)別僅為背板前緣鬃是否發(fā)達(dá)，豆簡(jiǎn)管薊馬背板前緣鬃退化，而華簡(jiǎn)管薊馬背板前緣鬃發(fā)達(dá)。從COI基因分子層面上也有極大的相似性，因此在系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中可以看到華簡(jiǎn)管薊馬嵌進(jìn)了豆簡(jiǎn)管薊馬分支內(nèi)。華簡(jiǎn)管薊馬和稻管薊馬二者僅在體表主要鬃端部尖細(xì)或膨大區(qū)別。因此，無(wú)論是分子還是形態(tài)數(shù)據(jù)均表明以上三者親緣關(guān)系較近。但由于本研究獲得的COI序列較少，因此無(wú)法說(shuō)明此三者的單系性。

圖1 運(yùn)用最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建陜西省漢中地區(qū)管薊馬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)

稻管薊馬分支中的④，經(jīng)形態(tài)學(xué)分析確定為華簡(jiǎn)管薊馬，但分子數(shù)據(jù)分析，系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)中其鑲嵌到稻管薊馬分支內(nèi)，分析原因可能是由于在其COI基因提取時(shí)破壞了某些重要的區(qū)分特征所致。因此建議在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中進(jìn)一步確定該條序列對(duì)應(yīng)的憑證標(biāo)本是否與華簡(jiǎn)管薊馬物種混淆。

分支①和③，依據(jù)形態(tài)特征，其均為豆簡(jiǎn)管薊馬，不同個(gè)體分別聚集為2個(gè)分支，表明豆簡(jiǎn)管薊馬可能存在隱存分類單元。

第二、三、四支：該分支由⑥、⑦、⑧和⑨三部分組成，經(jīng)憑證標(biāo)本的形態(tài)學(xué)鑒定為滑管薊馬屬、器管薊馬屬和薊馬科，利用形態(tài)學(xué)與分子數(shù)據(jù)結(jié)合，鑒定四者分別為：滑管薊馬屬、器管薊馬屬、蔥韭薊馬Thripsalliorum和小腺帶薊馬Taeniothripsglanduculus，前兩者屬于管薊馬科，后兩者屬于薊馬科，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果也表明其親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，支持其屬于不同的亞科。

3.3 種內(nèi)遺傳距離

利用MEGA5.05中的Kimuar雙參數(shù)模型，對(duì)5屬7種共18頭薊馬個(gè)體的COI基因序列的種內(nèi)及種間的遺傳距離進(jìn)行分析。結(jié)果表明(如表2)種內(nèi)遺傳距離為0.000～0.009，其中稻管薊馬和華簡(jiǎn)管薊馬的種內(nèi)遺傳距離均為0.001，豆簡(jiǎn)管薊馬的種內(nèi)遺傳距離為0.001～0.009，平均是0.004；種間遺傳距離平均為0.096，其中，豆簡(jiǎn)管薊馬與華簡(jiǎn)管薊馬的種間遺傳距離最小為0.005，蔥韭薊馬和小腺帶薊馬的種間遺傳距離最大為0.186。

4 結(jié)論與討論

在對(duì)5屬7種共18條薊馬標(biāo)本的COI序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)構(gòu)建，可輔助形態(tài)學(xué)進(jìn)一步確定物種，區(qū)分形態(tài)上難以區(qū)分的物種，如對(duì)簡(jiǎn)管薊馬屬的豆簡(jiǎn)管薊馬的鑒定給予很好的數(shù)據(jù)支持；其次，從分子水平上初步驗(yàn)證了豆簡(jiǎn)管薊馬與華簡(jiǎn)管薊馬之間的親緣關(guān)系較近。結(jié)合管薊馬形態(tài)學(xué)和生物學(xué)等特征，本研究結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)基本一致，證實(shí)所構(gòu)建的陜西省漢中地區(qū)管薊馬系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)真實(shí)有效，對(duì)陜西省漢中地區(qū)簡(jiǎn)管薊馬屬內(nèi)物種分類具有一定的幫助。

本研究薊馬DNA的提取采取無(wú)損傷提取方法，由于管薊馬個(gè)體較小，提取DNA量較少等原因，使得COI基因的提取成功率較低，顯得管薊馬COI基因樣本提取不足，數(shù)據(jù)范圍較狹小，物種的單系性分析缺乏較大量數(shù)據(jù)支持。

管薊馬種類豐富，個(gè)體微小，依據(jù)形態(tài)特征進(jìn)行物種鑒定存在一定的難度。DNA條形碼技術(shù)可以快速地確定物種的種類，尤其對(duì)個(gè)體微小、形態(tài)相近的物種進(jìn)行區(qū)分具有明顯優(yōu)勢(shì)。利用DNA條形碼技術(shù)對(duì)管薊馬種類進(jìn)行鑒定，結(jié)合形態(tài)學(xué)的分析可以快速、準(zhǔn)確地掌握管薊馬的種類，為后期陜西省漢中地區(qū)管薊馬物種多樣性調(diào)查研究和薊馬害蟲(chóng)防治措施方面提供科學(xué)依據(jù)；相信通過(guò)后期的努力，我們能夠優(yōu)化實(shí)驗(yàn)流程，減少實(shí)驗(yàn)誤差，擴(kuò)展數(shù)據(jù)樣本，使得該方法能夠更加準(zhǔn)確地鑒定整個(gè)陜南地區(qū)管薊馬種類，也可快速地將危害陜西植物的管薊馬快速有效進(jìn)行區(qū)分，為后續(xù)管薊馬的物種多樣性研究和管薊馬害蟲(chóng)的生物防治提供更加完善的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

[參考文獻(xiàn)]

[1] LAURENCE M.ThripsWiki-providing information on the World’s thrips[EB/OL].Australia:MediaWiki,2017[2017-11-20].http://thrips.info/wiki/Main_Page.

[2] 黨利紅.中國(guó)及東南亞管尾亞目系統(tǒng)學(xué)研究[D].北京：中國(guó)科學(xué)院大學(xué)，2014.

[3] 韓運(yùn)發(fā).中國(guó)經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)志：第五十五冊(cè)[M].北京:科學(xué)出版社,1997:195-198.

[4] 馮會(huì)文.甘肅中部薊馬區(qū)系研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.

[5] YU Wen-bin,HUANG Pan-hui,REE R H,et al.DNA barcoding ofPedicularisL. (Orobanchaceae):Evaluating four universal barcode loci in a large and hemiparasitic genus[J].Journal of Systematics and Evolution,2011,49(5):425-37.

[6] 武宇鵬,丁亮,李捷,等.DNA條形碼的應(yīng)用進(jìn)展及討論[J].環(huán)境昆蟲(chóng)學(xué)報(bào),2011,33(1):99-106.

[7] 屠云潔,陳國(guó)宏,高玉時(shí),等.3個(gè)地方雞種線粒體DNA COI基因條形碼遺傳多樣性研究[J].家畜生態(tài)學(xué)報(bào),2009,30(1):16-19.

[8] 馮毅,王莉,白云峰,等.基于COI序列快速鑒定花薊馬的DNA條形碼芯片初探[J].生物技術(shù)通報(bào),2009(8):169-173.

[9] 彭居俐,王緒禎,王丁,等.基于線粒體COI基因序列的DNA條形碼在鯉科鲌屬魚(yú)類物種鑒定中的應(yīng)用[J].水生生物學(xué)報(bào),2009,33(2):271-276.

[10] 王中鐸,郭昱嵩,陳榮玲,等.南海常見(jiàn)硬骨魚(yú)類COI條碼序列[J].海洋與湖沼,2009(5):608-614.

[11] 朱丹丹,謝瑾.基于COI基因?qū)矶昕评ハx(chóng)的分子系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系研究[J].農(nóng)技服務(wù),2016,10(33):9-10.

[12] 楊瑞生,陳玉波,王勇,等.DNA條形碼在柞樹(shù)主要鱗翅目害蟲(chóng)種類鑒定中的應(yīng)用[J].蠶業(yè)科學(xué),2017,43(5):750-756.