龍須菜揮發(fā)油的提取及抗菌抗蟲活性研究

王國(guó)蕊

逄錦龍2

張德蒙2

李 昉1,2

(1.青島科技大學(xué)海洋科學(xué)與生物工程學(xué)院，山東 青島 266000；2.青島明月海藻集團(tuán)有限公司海藻活性物質(zhì)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266400)

龍須菜(Gracilarialemaneiformis)隸屬于紅藻門杉藻目江蘺屬，多生長(zhǎng)于潮間帶至潮下帶的半埋于覆蓋有沙的巖石上[1]。目前已從龍須菜中分離出多種化合物[2-3]，具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤[4-5]、抗病毒、抗突變[6]、抗凝血、抗氧化[5]、抗菌等多種生理活性及藥用功能[7]。但對(duì)龍須菜揮發(fā)油的成分以及抗菌活性研究還相對(duì)較少，對(duì)龍須菜揮發(fā)油的抗鹵蟲活性也未見報(bào)道。

值得關(guān)注的是潮間帶海藻的揮發(fā)和半揮發(fā)性成分具有很好的抗菌和抗氧化等活性，可用于開發(fā)藥品或者保健品[8]。同時(shí)，同種植物的揮發(fā)油用不同的方法提取在成分以及活性方面有較大差異[9]。因此本研究以龍須菜為對(duì)象，利用氣相色譜-質(zhì)譜分析方法對(duì)比不同提取方法得到的揮發(fā)油成分，分析揮發(fā)油主體成分，并研究比較2種揮發(fā)油對(duì)幾種常見致病菌抗菌作用以及對(duì)鹵蟲殺蟲活性的差異，旨在探索龍須菜揮發(fā)油的最佳提取方法，并為擴(kuò)展大型紅藻龍須菜的應(yīng)用范圍提供一定理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

1.1.1 材料與試劑

龍須菜：于2016年5月采于山東威海養(yǎng)殖場(chǎng)；

大腸桿菌O157(EscherichiacoliO157)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、沙門氏菌(Salmonellaenterica)、單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、副溶血性弧菌(Vibrioparahemolyticus)：中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所；

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母浸膏5 g，氯化鈉10 g，瓊脂20 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2～7.4；

其他試劑均為分析純。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

氣相質(zhì)譜聯(lián)用儀：GCMS-QP2010型，日本島津公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠；

循環(huán)水式多用真空泵：SHZ-95B型，鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司；

冷凍干燥機(jī)：FD-1A-80型，上海比朗儀器制造有限公司；

立式壓力蒸汽滅菌器：BXM-30R型，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 直接水蒸氣蒸餾法 將1 kg新鮮龍須菜冷凍干燥，粉碎，對(duì)龍須菜粉末直接進(jìn)行水蒸氣蒸餾得龍須菜揮發(fā)油(D-GLS)，用重蒸二氯甲烷萃取，密封待測(cè)。

1.2.2 溶劑提取-水蒸氣蒸餾法 將1 kg新鮮龍須菜晾干至恒重，粉碎，浸泡于等體積重蒸甲醇中，提取3次，超聲輔助、浸提均為24 h，將浸提液于減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器中蒸干，得龍須菜粗提物浸膏。最后對(duì)粗提物浸膏進(jìn)行水蒸氣蒸餾得到龍須菜揮發(fā)油(S-GLS)，用重蒸二氯甲烷萃取，密封待測(cè)。

1.2.3 GC-MS分析條件

(1) 氣相色譜條件：柱箱溫度50 ℃，進(jìn)樣口溫度250 ℃，進(jìn)樣量1 μL，不分流，進(jìn)樣時(shí)間1 min；載氣He，壓力100 kPa，總流量50 mL/min，柱流量1.69 mL/min；柱溫從50 ℃開始，維持0 min，以5 ℃/min升溫到220 ℃，維持5 min，再以5 ℃/min升溫到300 ℃，維持0 min。

(2) 質(zhì)譜條件：EI離子源，電離源(70 eV)，離子源溫度200 ℃，接口溫度300 ℃，溶劑延遲時(shí)間3 min，質(zhì)量數(shù)掃描范圍為35～500m/z。

1.2.4 化合物結(jié)構(gòu)與含量分析 利用儀器自帶譜庫(kù)進(jìn)行檢索，確定化合物結(jié)構(gòu)，只報(bào)道相似度>80%的物質(zhì)，采用色譜峰面積歸一化法確定各組分相對(duì)含量，用百分比表示。

1.2.5 抗菌試驗(yàn) 將D-GLS揮發(fā)油和S-GLS揮發(fā)油分別用色譜甲醇溶解，濃度均為10 mg/mL，陽(yáng)性對(duì)照為4 mg/mL阿莫西林的二甲基亞砜(DMSO)溶液。各取樣品5 μL到濾紙片(直徑6 mm)，晾干，貼到涂菌的LB固體平板上，置于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察抑菌圈大小。按式(1)計(jì)算抑菌率。

(1)

式中：

c——抑菌率，%；

d0——濾紙片直徑，mm；

d1——供試樣品抑菌圈直徑，mm；

d2——陽(yáng)性對(duì)照，mm。

1.2.6 抗鹵蟲活性試驗(yàn) 參照李昉等[10]的方法，取190 μL鹵蟲幼蟲懸浮液，加入到96孔板中，每孔鹵蟲控制在16條左右。用DMSO將兩種揮發(fā)油配制成梯度溶液，每孔加入樣品10 μL，使其最終濃度分別為0.06，0.08，0.10，0.12，0.14，0.16，0.18，0.20 mg/mL，并設(shè)置海水和DMSO對(duì)照，每個(gè)樣品做6個(gè)平行。在25 ℃下培養(yǎng)24 h，記錄鹵蟲死亡個(gè)數(shù)，計(jì)算死亡率和半致死濃度LD50。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法的龍須菜揮發(fā)性成分

根據(jù)水蒸氣蒸餾法得到的D-GLS揮發(fā)油，經(jīng)GC-MS分析后得龍須菜揮發(fā)油總離子流色譜圖(圖1)，該方法得到的揮發(fā)油組分在3.085 min開始出峰并且在25～35 min集中出峰，由表1可知，共得到68種成分，包括烷烴20種、烯烴6種、醛類9種、醇類12種、酮類3種、羧酸及酯15種和其它化合物3種。其中相對(duì)含量>5%的化合物依次有：2-辛烯醛(22.29%)、二十烷(18.84%)、4-亞乙烯基環(huán)己烯(7.81%)和1-辛烯-3-醇(6.91%)。而采用溶劑提取-水蒸氣蒸餾法得到的S-GLS揮發(fā)油，經(jīng)GC-MS分析后得龍須菜揮發(fā)油總離子流色譜圖(圖2)，該方法得到的揮發(fā)油組分出峰時(shí)間集中在20～35 min，由表2可知，共得到56種成分，包括烷烴20種、醛類1種、醇類6種、酮類2種、羧酸及酯17種和其它化合物10種。其中相對(duì)含量>5%的化合物有：二十烷(37.41%)和棕櫚酸甲酯(6.89%)。由圖3可知，S-GLS揮發(fā)油相對(duì)于D-GLS揮發(fā)油，其醛類成分由24.69%下降至0.2%，羧酸及酯類成分由9.02%提高至21.54%，在一定程度上說(shuō)明，直接水蒸氣蒸餾揮發(fā)油成分可能會(huì)導(dǎo)致羧酸氧化，醛類成分增加?？傮w來(lái)看，烴類和羰基類化合物是龍須菜揮發(fā)油的主體成分。

圖1 直接水蒸氣蒸餾法所得龍須菜揮發(fā)油成分GC-MS譜圖Figure 1 TIC chromatograms of volatile oil compounds in G.Lemaneiformis with direct steam distillation

圖2 溶劑提取-水蒸氣蒸餾法所得龍須菜揮發(fā)油成分GC-MS譜圖Figure 2 TIC chromatograms of volatile oil compounds in G.Lemaneiformis with solvent extraction-steam distillation

2.2 對(duì)龍須菜揮發(fā)油主體成分解析

2.2.1 烴類化合物 由圖3可知，烴類化合物是龍須菜揮發(fā)油的最主要成分，嗅覺閾值多數(shù)較高，對(duì)揮發(fā)油的氣味貢獻(xiàn)不大。直接水蒸氣蒸餾法和溶劑提取-水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中烷烴含量分別為38.98%和60.01%，另外直接水蒸氣蒸餾法提取的揮發(fā)油中還有10.41%的烯烴，其中角鯊烯是一種直鏈三萜化合物，具有類似紅細(xì)胞攝氧功能，可生成活化的氧化角鯊烯，促進(jìn)新陳代謝，提高機(jī)體免疫力，因而常作為功效成分添加于保健食品中[11]。2種方法提取的揮發(fā)油中飽和烷烴均是其主要物質(zhì)，而徐年軍等[12]所得龍須菜揮發(fā)油的結(jié)果是以烯烴(61.67%)為主要成分，可能與龍須菜的生長(zhǎng)季節(jié)、龍須菜揮發(fā)性物質(zhì)的提取方法和檢測(cè)條件有關(guān)。

表1 直接水蒸氣蒸餾法所得龍須菜揮發(fā)油成分Table 1 Volatile oil compounds in G.Lemaneiformis with direct steam distillation

表2 溶劑提取-水蒸氣蒸餾法所得龍須菜揮發(fā)油成分Table 2 Volatile oil compounds in G.Lemaneiformis with solvent extraction-steam distillation

圖3 2種提取方法所得龍須菜揮發(fā)油組成與含量Figure 3 The volatile oil composition and content from two extraction methods in G.Lemaneiformis

2.2.2 醛類化合物 醛類化合物主要是脂肪氧化的產(chǎn)物[13]，具有較低的嗅覺閾值，是揮發(fā)油氣味的主要來(lái)源。由表1和圖3可知，直接水蒸氣蒸餾法醛類含量為24.69%。其中2-辛烯醛含量最高(為22.29%)，其嗅覺閾值非常低(3 μg/kg)，具有脂肪和黃瓜味[14]，是氣味的主要貢獻(xiàn)者。還檢測(cè)出2,6-壬二烯醛、2,4-庚二烯醛、正己醛、庚醛和十四醛，通常會(huì)呈現(xiàn)出辛辣和令人不愉快的腥味、脂肪味、草味等刺激性味道[15]。而溶劑提取-水蒸氣蒸餾法只檢測(cè)到0.2%的2-甲基-5-異丙烯基環(huán)戊-1-烯甲醛，大大降低了揮發(fā)油的不良?xì)馕丁?/p>

2.2.3 醇類化合物 醇類化合物相比于醛類一般嗅覺閾值較高。由表1和圖3可知，直接水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油中醇類含量為14.78%，其中1-辛烯-3-醇為6.91%，且嗅覺閾值較低(10 μg/kg)[16]，具有類似蘑菇香氣和泥土味[17]。葉綠醇是雙萜類化合物，具有花香和脂香氣，是合成維生素K及維生素E的原料，具有一定的抗氧化作用[18]。由表2和圖3可知，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法揮發(fā)油中只有8.37%，多為嗅覺閾值更高的飽和醇，而具有抗氧化作用的葉綠醇含量從1.15% 提高到3.17%。

2.2.4 酮類化合物 酮類化合物是由于不飽和脂肪熱氧化和氨基酸降解，嗅覺閾值比醛類高[19-20]。由表1、2可知，2種方法均檢測(cè)出少量β-紫羅蘭酮和植酮。β-紫羅蘭酮為萜類物質(zhì)，在一些海洋真菌和藻類中都有存在[21-22]，具有紫羅蘭香和木香，有抗真菌作用，此外還具有較強(qiáng)的抑癌作用[23-24]。

2.2.5 羧酸及酯類化合物 由圖3可知，羧酸及酯類化合物相比于直接水蒸氣蒸餾法，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法使羧酸及酯類含量從9.02%提高到21.54%。由表1、2可知，2種揮發(fā)油中都檢測(cè)出包括花生四烯酸(ARA)和二十碳五烯酸(EPA)等多種多不飽和脂肪酸(PUFAs)，PUFAs對(duì)人體有非常重要的生理功能，可以調(diào)節(jié)人體脂質(zhì)代謝、增加血管彈性、降血壓、降血脂、預(yù)防心腦血管疾病，促進(jìn)生長(zhǎng)發(fā)育，此外對(duì)抗癌、抗糖尿病、抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、延緩衰老、減肥、美容等方面均具有重要的生理作用[25-26]。

2.3 龍須菜揮發(fā)油抗菌作用

由表3可知，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法龍須菜揮發(fā)油在濃度為10 mg/mL條件下對(duì)金黃色葡萄球菌、單增李斯特菌、大腸桿菌O157、沙門氏菌和副溶血性弧菌均有一定抗菌作用，且抑菌作用均優(yōu)于直接水蒸氣蒸餾法的，抑菌效果為副溶血性弧菌>單增李斯特菌>沙門氏菌>大腸桿菌O157>金黃色葡萄球菌，其中對(duì)副溶血性弧菌抑菌率最高，可達(dá)17.69%。

表3 龍須菜揮發(fā)油的抑菌作用Table 3 The bacteriostatic action of volatile oil in G.Lemaneiformis

2.4 龍須菜揮發(fā)油抗鹵蟲活性

由圖4可知，隨著濃度的升高，揮發(fā)油對(duì)鹵蟲的殺蟲活性明顯增強(qiáng)。在相同濃度條件下，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法龍須菜揮發(fā)油的殺蟲活性均高于直接水蒸氣蒸餾法的。2種揮發(fā)油在0.16 mg/mL的濃度條件下，對(duì)鹵蟲的致死率均超過(guò)50%。

由圖4數(shù)據(jù)可模擬計(jì)算，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法龍須菜揮發(fā)油和直接水蒸氣蒸餾法龍須菜揮發(fā)油對(duì)鹵蟲LD50分別為0.126，0.162 mg/mL，且2種揮發(fā)油殺蟲活性要明顯高于敵敵畏、氯氰菊酯和氧樂(lè)果3種常見化學(xué)農(nóng)藥的[12]。

圖4 龍須菜揮發(fā)油的殺蟲活性結(jié)果Figure 4 The insecticidal activities of volatile oil in G.Lemaneiformis

3 結(jié)論

(1) 相比于直接水蒸氣蒸餾法，溶劑提取-水蒸氣蒸餾法得龍須菜揮發(fā)油營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高，含有較高的羧酸及酯類。提取方法對(duì)揮發(fā)油成分產(chǎn)生明顯影響。

(2) 龍須菜揮發(fā)油具有一定的廣譜抗菌能力和較好的殺蟲活性。溶劑提取-水蒸氣蒸餾法是獲得高活性龍須菜揮發(fā)油的有效方法。

(3) 本研究所得龍須菜揮發(fā)油對(duì)鹵蟲有較強(qiáng)的殺蟲活性，證明該揮發(fā)油具有作為生物農(nóng)藥的可能，為擴(kuò)展大型紅藻龍須菜的應(yīng)用范圍提供了一定理論依據(jù)。由于尚未明確揮發(fā)油中抗蟲抗菌的活性物質(zhì)是哪些單體化合物及可能的機(jī)理，今后需要在這些方面繼續(xù)深入開展研究工作。

[1] 曾呈奎.中國(guó)黃渤海海藻[M].北京: 科學(xué)出版社, 2009: 180.

[2] LU Hui-ming, XIE Hai-hui, GONG Ying-xue, et al.Secondary metabolites from the seaweedGracilarialemaneiformisand their allelopathic effects onSkeletonemacostatum[J].Biocheml Syst Ecol, 2011, 39(4/5/6): 397-400.

[3] 陸崇玉, 鄧赟, 梅玲, 等.龍須菜化學(xué)成分研究[J].中草藥, 2011, 42(6): 1 069-1 071.

[4] 梅文莉, 戴好富, 徐軍田.龍須菜的有機(jī)酸組成及其細(xì)胞毒活性[J].中國(guó)海洋藥物, 2006, 25(2): 45-47.

[5] 陳美珍, 余杰, 廖灶輝, 等.龍須菜多糖抑瘤活性及對(duì)荷瘤小鼠抗氧化作用的研究[J].中國(guó)海洋藥物, 2008, 27(2): 46-49.

[6] 陳美珍, 余杰, 龍梓潔, 等.龍須菜多糖抗突變和清除自由基作用的研究[J].食品科學(xué), 2005, 26(7): 219-222.

[7] 陸崇玉, 鄧赟, 宋欣, 等.龍須菜活性成分的研究開發(fā)進(jìn)展[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥, 2011, 23(3): 711-712.

[8] KARABAY-YAVASOGLU N U, SUKATAR A, OZDEMIR G, et al.Antimicrobial activity of volatile components and various extracts of the red algaJaniarubens[J].Phytother Res, 2007, 21(2): 153-156.

[9] 衛(wèi)強(qiáng), 魯輪, 龍先順, 等.提取方法對(duì)木槿葉揮發(fā)油成分及其對(duì)肺癌A549細(xì)胞抑制作用的影響[J].食品與機(jī)械, 2016, 32(4): 160-166.

[10] 李昉, 杜方鵬.一株牛蒡共生真菌殺蟲活性的研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2014, 26(9): 1 357-1 360.

[11] 邱春媚, 殷光玲.角鯊烯軟膠囊提高缺氧耐受力的研究[J].中國(guó)糧油學(xué)報(bào), 2013, 28(2): 52-54.

[12] 徐年軍, 何艷麗, 唐軍, 等.龍須菜(Gracilarialemaneiformis) 高溫逆境代謝產(chǎn)物的GC-MS分析[J].海洋與湖沼, 2009, 40(2): 221-227.

[13] TIES P, BARRINGER S.Influence of lipid content and lipoxygenase on flavor volatiles in the tomato peel and flesh[J].J Food Sci, 2012, 77(7): C830-C837.

[14] 張紅燕, 李曄, 袁貝, 等.金槍魚油冬化前后脂肪酸含量和主體風(fēng)味的解析[J].核農(nóng)學(xué)報(bào), 2017, 31(2): 314-324.

[15] 施文正, 王錫昌, 陶寧萍, 等.致死方式對(duì)養(yǎng)殖草魚肉揮發(fā)性成分的影響[J].水產(chǎn)學(xué)報(bào), 2011, 35(3): 456-465.

[16] 王雪鋒, 涂行浩, 吳佳佳, 等.草魚的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)及關(guān)鍵風(fēng)味成分分析[J].中國(guó)食品學(xué)報(bào), 2014(12): 182-189.

[17] CHEN De-wei, ZHANG Min.Analysis of volatile compounds in Chinese mitten crab (Eriocheirsinensis)[J].J Food Drug Anal, 2006, 14(3): 297-303.

[18] 周書娟.褐藻羊棲菜等化學(xué)成分及其抗氧化活性的研究[D].溫州: 溫州大學(xué), 2015: 21-24.

[19] SUN S M, CHUNG G H, SHIN T S.Volatile compounds of the green alga,Capsosiphonfulvescens[J].J Appl Phycol, 2012, 24(5): 1 003-1 013.

[20] FRATINII G, LOIS S, PAZOS M, et al.Volatile profile of Atlantic shellfish species by HS-SPME GC/MS[J].Food Res Int, 2012, 48(2): 856-865.

[21] KAMENARSKA Z, IVANOVA A, STANCHEVA R, et al.Volatile compounds from some Black Sea red algae and their chemotaxonomic application[J].Bot Mar, 2006, 49(1): 47-56.

[22] ABDELBAKY H H, SHALLAN M A, BAROTY G E, et al.Volatile compounds of the microalgaChlorellavulgarisand their phytotoxic effect[J].Pak J Biol Sci, 2002, 5(1): 61-65.

[23] 劉家仁, 陳炳卿, 楊艷梅, 等.β-紫羅蘭酮抑制SGC-7901細(xì)胞潛在的轉(zhuǎn)移作用[J].衛(wèi)生研究, 2005, 34(4): 435-438.

[24] DONG Hong-wei, ZHANG Shuang, SUN Wen-guang, et al.β-Ionone arrests cell cycle of gastric carcinoma cancer cells by a MAPK pathway[J].Arch Toxicol, 2013, 87(10): 1 797-1 808.

[25] 王萍, 張銀波, 江木蘭.多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展[J].中國(guó)油脂, 2008, 33(12): 42-46.

[26] 孫翔宇, 高貴田, 段愛莉, 等.多不飽和脂肪酸的研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技, 2012, 33(7): 418-423.