二甲雙胍對HER2陽性胃癌細胞的增殖抑制作用

歐陽偉，羅玉君，洪嘉茹

廣東省深圳市龍崗區(qū)人民醫(yī)院內(nèi)科，廣東 深圳 518172

作為我國人群中的高發(fā)腫瘤，胃癌的檢測和治療已經(jīng)經(jīng)歷了幾十年的發(fā)展，但由于胃癌發(fā)病的隱秘性，且作為致癌因素的幽門螺桿菌在我國人群的陽性率居高不下，這就導(dǎo)致了胃癌的治療狀況和臨床預(yù)后差強人意[1]。隨著對胃癌致病條件和發(fā)病因素研究的不斷深入，我們發(fā)現(xiàn)部分胃癌患者存在與乳腺腫瘤交叉陽性的腫瘤相關(guān)基因HER2，鑒于乳腺腫瘤的治療經(jīng)驗，已經(jīng)臨床應(yīng)用了HER2針對性抗體曲妥珠單抗，并取得了一定療效，但相比乳腺腫瘤的治療效果療效較差[2]。以上這種狀況促使消化醫(yī)師尋找能與曲妥珠單抗配伍的藥物并提高曲妥珠單抗的抗腫瘤殺傷作用，在此過程中，從對胃癌合并糖尿病患者的治療資料出現(xiàn)靈感，二甲雙胍的使用改善了HER2陽性胃癌患者的臨床治療效果和臨床預(yù)后。為探討二甲雙胍對HER2陽性胃癌細胞的增殖抑制作用，現(xiàn)進行針對性實驗，具體報道如下。

1 材料與方法

1.1材料HER2陽性胃癌細胞株N87系購自中國科學(xué)院北京細胞庫；DEME培養(yǎng)基購自美國HyClone 公司；二甲雙胍購自上海信誼有限公司；曲妥珠單抗購自北京市康德樂藥房；鹽酸四咪唑購自江蘇康樂新材料科技有限公司。

1.2細胞培養(yǎng)將HER2陽性胃癌細胞株N87細胞置于質(zhì)量濃度為100 g/L胎牛血清的DEME培養(yǎng)基中，將溫度調(diào)至37 ℃，而后將培養(yǎng)基置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2條件下的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(溫度為37 ℃，濕度為60%)。培養(yǎng)基更換速度為2 d/次。

1.3藥物干預(yù)對照組：使用PBS緩沖液將曲妥珠單抗溶解配成50 μg/L的液體，按照上述細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后觀察細胞增殖情況。研究組：使用PBS緩沖液將曲妥珠單抗溶解配成4 mg/L的液體，而后使用此溶液將二甲雙胍溶解稀釋配成2 mg/L，而后再稀釋成50 μg/L,按照上述細胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)24 h、48 h、72 h后觀察細胞增殖情況。

1.4觀察指標用四唑鹽比色法檢測24 h、48 h、72 h HER2陽性胃癌細胞存活和生存狀況：選擇對數(shù)期的HER2陽性胃癌細胞制備成單個細胞懸液，調(diào)整細胞濃度為(5.0～10.0)×104ml-1，于96孔板中，每孔加入細胞懸液100 ml，外圍孔加入100 ml PBS緩沖液，將96孔板置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2條件下的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，待細胞貼壁后按實驗設(shè)計的藥物干預(yù)，在加藥后24 h、48 h、72 h更換培養(yǎng)基，加入含有CCK-8的培養(yǎng)基(1∶10的DEME)，然后于培育箱中避光孵育2.5 h，以3 000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，去除上清，用酶標儀測定各孔吸光度值。Western blotting法檢測HER2陽性胃癌細胞株中細胞Cyclin D1、PI3K、mTOR三種蛋白的表達情況，分析二甲雙胍對HER2陽性胃癌細胞的增殖抑制作用。

2 結(jié)果

HER2陽性胃癌細胞體外培養(yǎng)進行良好。關(guān)于腫瘤細胞抑制作用，研究組24 h、48 h、72 h HER2陽性胃癌細胞存活率低于對照組，腫瘤相關(guān)蛋白表達情況低于對照組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(見表1～2)。

表1 HER2陽性胃癌細胞存活狀況對比分析Tab 1 Comparison of survival of HER2 positive %

表2 腫瘤相關(guān)蛋白表達狀況比較Tab 2 Comparison of expressions of tumor associated

3 討論

胃癌是臨床常見的惡性程度較高的惡性腫瘤，早期多無明顯臨床表現(xiàn)，且具有淋巴轉(zhuǎn)移早、復(fù)發(fā)率高的臨床特點，給人類生命和健康造成了嚴重威脅[3]。胃癌的發(fā)生與癌基因激活、抑癌基因失活等因素有關(guān)，且是一個多階段、多因素逐漸推進的過程[4]。根據(jù)對HER2陽性胃癌合并糖尿病患者的治療資料，治療過程中為起到降糖效果而使用二甲雙胍，與單純HER2陽性胃癌患者的治療效果綜合比較，合并糖尿病的患者治療效果優(yōu)于單純HER2陽性胃癌患者，因此，我們推斷二甲雙胍對HER2陽性胃癌細胞存在影響[5]。HER2通常發(fā)生于乳腺癌患者，本質(zhì)為人類表皮生長因子受體，同時具有酪氨酸激酶活性，在接受表皮生長因子刺激后，會繼發(fā)激活多種促進細胞增殖的局部因子和化學(xué)物質(zhì)，可導(dǎo)致局部細胞的非調(diào)控性增長，進而導(dǎo)致腫瘤的出現(xiàn)。目前對于HER2陽性細胞，其針對性抗體曲妥珠單抗已經(jīng)在臨床中得到普遍應(yīng)用，通過封閉HER2受體，阻斷其促進局部細胞非調(diào)控性生長增殖的效果，起到腫瘤抑制作用和控制轉(zhuǎn)移作用，其在乳腺癌的使用中，在協(xié)同其他腫瘤殺傷化療藥物作用的同時，可提高HER2陽性腫瘤細胞對化療藥物的殺傷作用，提高化療反應(yīng)性，并改善臨床預(yù)后[6]。鑒于二甲雙胍可提高曲妥珠單抗治療HER2陽性胃癌患者的腫瘤抑制作用，考慮二甲雙胍可能存在增強曲妥珠單抗與HER2受體之間的結(jié)合力，調(diào)控HER2陽性胃癌細胞的細胞增殖周期，為其他化療藥物發(fā)揮作用提供準備；或是二甲雙胍對于HER2陽性胃癌細胞存在某種細胞殺傷作用起到直接抑制作用，這極大地刺激我們加強對二甲雙胍對HER2陽性胃癌細胞的作用機制，將更好地應(yīng)用于臨床[7]。

對比分析單純曲妥珠單抗組與曲妥珠單抗聯(lián)合二甲雙胍組治療的HER2陽性胃癌細胞的存活狀況，發(fā)現(xiàn)在24 h、48 h、72 h 3個時間點，后者相比前者腫瘤細胞的增殖得到明顯的抑制，并結(jié)合兩組腫瘤細胞的腫瘤相關(guān)蛋白表達結(jié)果提示，曲妥珠單抗聯(lián)合二甲雙胍組體外細胞的Cyclin D1、PI3K、mTOR三種物質(zhì)表達量明顯低于單純曲妥珠單抗組，綜合HER2陽性胃癌的發(fā)病機制對二甲雙胍抑制HER2陽性胃癌細胞作用分析如下：(1)二甲雙胍對細胞增殖具有調(diào)控作用，從二甲雙胍組Cyclin D1蛋白表達量明顯降低來看，二甲雙胍通過抑制細胞周期蛋白及細胞周期蛋白控制的激酶表達量來看，同時，我們認為，其還可通過誘導(dǎo)細胞分裂從G0期進入S期，但阻止細胞分裂從S期進入G1期，將HER2陽性胃癌細胞阻滯與細胞分裂S期，增大其對曲妥珠單抗及其他化療藥物的敏感性，進而協(xié)同提高其他藥物的抗腫瘤作用[8]；(2)二甲雙胍可抑制胞內(nèi)磷脂醇激酶PI3K，而PI3K又是細胞生長因子HER2受體的重要下游產(chǎn)物，故二甲雙胍可通過阻斷HER2陽性胃癌細胞的中間產(chǎn)物，阻斷HER2受體誘導(dǎo)的多種細胞增殖信號物質(zhì)的激活和作用，其中，最重要的是絲-蘇氨酸激酶mTOR，二甲雙胍可通過控制mTOR的表達，同時通過中間物質(zhì)腫瘤抑制因子tuberin的激活作用間接抑制mTOR的活性，進而抑制蛋白質(zhì)尤其是細胞骨架蛋白的合成進而影響細胞增長和增殖[9]。

此外，二甲雙胍對于HER2陽性胃癌細胞的增殖抑制作用還存在其他作用機制。二甲雙胍可通過調(diào)控激活A(yù)MPK的過程起到磷酸化調(diào)節(jié)細胞代謝酶，影響細胞增殖復(fù)制所需要的酶類，控制細胞增殖所需要的能量和代謝酶，進而起到增殖抑制作用[10]。二甲雙胍通過激活調(diào)控機體凋亡蛋白的表達對HER2陽性胃癌細胞的增殖起到抑制殺傷作用[11]，通過抑制白介素-6和轉(zhuǎn)化生長因子及其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用阻止腫瘤細胞的增殖作用，此兩方面作用可側(cè)面協(xié)同二甲雙胍對HER2陽性胃癌細胞的增殖抑制作用[12]。

綜上所述，在HER2陽性胃癌細胞的作用方面，二甲雙胍更能控制腫瘤細胞的增殖狀態(tài)，降低腫瘤相關(guān)蛋白的表達狀況，起到腫瘤細胞的增殖抑制作用[10]。隨著胃癌發(fā)病機制和治療藥理作用研究的不斷深入，相信二甲雙胍在HER2陽性胃癌細胞增殖抑制方面的優(yōu)勢將被不斷發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍在HER2陽性胃癌患者腫瘤治療中的應(yīng)用將會得到廣泛推廣。

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