5-氮雜-2-脫氧胞苷及曲古抑菌素A對人胃癌SNU-1細胞系中DLC-1基因啟動子甲基化及mRNA表達的影響

賈 皚，秦 潔，任 莉，范修德

西安交通大學第一附屬醫(yī)院 1.消化內(nèi)科； 2.感染科，陜西 西安 710061

胃癌的病因復雜，其發(fā)生、發(fā)展是一個多因素參與的多階段復雜過程，抑癌基因啟動子區(qū)甲基化成為胃癌發(fā)生、發(fā)展的早期事件。抑癌基因表達量減少是發(fā)生胃癌的關鍵性因素[1]。DLC-1基因是與胃癌相關的重要抑癌基因之一，DLC-1基因的缺失表達與胃癌的發(fā)生、發(fā)展有密切關系[2]。本實驗選擇抑癌基因DLC-1為研究靶點，以人胃癌SNU-1細胞株為研究對象，應用甲基化特異性聚合酶鏈式反應(methylation-specific-polymerase chain reaction, MSP)和實時熒光定量PCR的實驗方法，分析5-Aza-dC和曲古抑菌素A (trichostatin A, TSA)對DLC-1基因在胃癌細胞SNU-1中的甲基化水平和mRNA表達的影響，為5-Aza-dC和TSA應用于胃癌的臨床治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1一般材料細胞株：人胃癌SNU-1細胞株購自ATCC庫。5-Aza-dC、TSA(Sigma公司，美國)?；蚪MDNA提取試劑盒(OMEGA公司，美國)。重亞硫酸鹽修飾試劑盒(MILLIPORE公司，美國)。RPMI 1640培養(yǎng)基干粉、胎牛血清(Gibco公司，美國)；DMSO(北京索萊寶科技有限公司，中國)、引物合成(南京金斯瑞科技有限公司，中國)；Tap Mix(熱啟動Taq酶)、6×DNA上樣緩沖液、DNA marker、6×DNA上樣緩沖液(北京天根生物科技有限公司，中國)。

1.2方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：人胃癌SNU-1細胞株用質量濃度為100 g/L的FBS血清RPMI 1640培養(yǎng)基置于37 ℃、體積分數(shù)為5%的CO2和95%濕度空氣的恒溫密閉式培養(yǎng)箱中貼壁培養(yǎng)。此細胞為單層貼壁細胞，每天觀察細胞生長情況，根據(jù)培養(yǎng)液顏色變化，2～3 d更換1次培養(yǎng)液，等待細胞生長處于對數(shù)生長期時，予質量濃度為2.5 g/L的胰蛋白酶消化傳代。

1.2.2 細胞株分組：采用體外培養(yǎng)的人胃癌SNU-1細胞系，將實驗分成4組：(1)對照組：未加入任何藥物。(2)5-Aza-dC組：加入濃度為5 μmol/L的5-Aza-dC培養(yǎng)液；(3)TSA組：加入濃度為300 nmol/L的TSA培養(yǎng)液；(4)5-Aza-dC+TSA組：向培養(yǎng)瓶內(nèi)加入濃度為5 μmol/L的5-Aza-dC培養(yǎng)24 h后，再加入濃度為300 nmol/L的TSA培養(yǎng)液共同培養(yǎng)；以上每組細胞均培養(yǎng)72 h，每24 h更換1次培養(yǎng)液。

1.2.3 MSP：采用MSP方法檢測以上各組藥物干預72 h后人胃癌SNU-1細胞DLC-1基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)。取對數(shù)生長期的細胞，以酚/氯仿法提取DNA，并對其行亞硫酸氫鹽修飾，將修飾后的DNA用Wizard DNA clean-up Systerm純化體系混勻、過柱，經(jīng)脫鹽、純化回收，洗脫進50 μl的雙蒸水中，脫去硫化基團，制備DNA。以修飾后的DNA為模板行MSP擴增(見表1)，25 μl的擴增體系：DNA 200 ng，2 mmol/L NTP 1.5 μl，10×PCR緩沖液3 μl，25 mmol/L的MgCl22.4 μl，上下游引物各1 μl， 5 U/μl TaqDNA聚合酶12.5 μl，100倍SYBR Green I 0.1 μl，用ddH2O將總體積補齊至25 μl。條件為：95 ℃ 5 min； 然后以95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，擴增30個循環(huán)；72 ℃時延伸5 min。取PCR產(chǎn)物，用質量濃度為25 g/L的瓊脂糖凝膠進行電泳，凝膠分析儀行拍照分析。

表1 甲基化特異性PCR引物Tab 1 Specific PCR primers for methylation

1.2.4 qPCR檢測5-Aza-dC及TSA對人胃癌SNU-1細胞株DLC-1 mRNA表達的影響：采用qPCR方法檢測以上各組藥物干預72 h后人胃癌SNU-1細胞DLC-1基因mRNA表達水平。細胞總RNA提取及其qPCR法測定藥物作用細胞后，常規(guī)收集細胞，并提取總RNA(按Trizol說明書操作)。進行反轉錄及PCR擴增。反轉錄體系為：67.2 ng RNA與1 μl Oligo(dT)混勻后，70 ℃處理5 min，立即冰浴，再加入2 μl 5×gDNA Eraser Buffer、1 μl gDNA Eraser、無RNA酶水補足體系至10 μl，5×PrimeScript×Buffer 2 4 μl、PrimeScript×RT Enzyme Mix 1 μl、混勻后37 ℃溫育60 min。PCR反應體系為：SYBR Premix TaqTMⅡ(2×)12.5 μl，模板cDNA 2 μl，上下游引物各1 μl(10 μmol/L)，去離子水補足至25 μl。PCR產(chǎn)物于質量濃度為20 g/L的瓊脂糖凝膠電泳后觀察，UVP凝膠成像儀攝像，其中DLC-1細胞為陽性對照，GAPDH為內(nèi)參對照。用Quantity One 4.5.2圖像分析軟件分別讀取SNU-1細胞和SNU-1細胞DLC-1及GAPDH的斑點密度掃描值，進行相對定量，實驗重復3次。序列及擴增條件如表2所示。

表2 qPCR引物設計Tab 2 Primer design for qPCR

2 結果

2.1MSP檢測藥物干預對DLC-1啟動子甲基化水平的影響本實驗經(jīng)MSP檢測胃癌細胞經(jīng)過72 h藥物干預后對DLC-1基因甲基的表達水平。以DLC-1基因組DNA為模板，經(jīng)過MSP擴增后，產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)了以下3種甲基化狀態(tài)(見圖1)，非甲基化：非甲基化產(chǎn)物中有目的條帶，甲基化產(chǎn)物中無目的條帶；半甲基化：甲基化產(chǎn)物和非甲基化產(chǎn)物同時出現(xiàn)目的條帶；全甲基化：甲基化產(chǎn)物中出現(xiàn)目的條帶，非甲基化產(chǎn)物中無目的條帶。

在胃癌SNU-1細胞中，未加任何藥物干預的對照組中DLC-1基因呈甲基化狀態(tài)；經(jīng)過5-Aza-dC藥物干預后的胃癌細胞，DLC-1基因出現(xiàn)明顯的非甲基化條帶，甲基化條帶亮度減弱；胃癌細胞經(jīng)TSA作用后，條帶無明顯變化；胃癌細胞經(jīng)過5-Aza-dC+TSA聯(lián)合干預后，DLC-1基因甲基化條帶明顯減弱，并出現(xiàn)非甲基化條帶。

注：U：非甲基化引物；M：甲基化引物；1：對照組；2：5-Aza-dC

2.2qPCR檢測藥物干預對DLC-1mRNA水平的影響各組細胞中DLC-1基因mRNA相對表達量以對照組的mRNA水平作為1，其他三組加藥細胞的mRNA表達量平均相對含量與對照組比較：5-Aza-dC組DLC-1 mRNA表達量是對照組的2.22倍，TSA組DLC-1 mRNA表達量是對照組的2.20倍，5-Aza-dC+TSA組DLC-1 mRNA表達量是對照組的4.50倍(見圖2)。故5-Aza-dC、TSA、5-Aza-dC+TSA組DLC-1 mRNA相對表達量與對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；5-Aza-dC組、TSA組DLC-1 mRNA相對表達量與5-Aza-dC+TSA組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。

注：與對照組比較，*P<0.05; 與5-Aza-dC+TSA組比較，ΔP<0.05。

3 討論

本實驗所研究的DLC-1基因，全稱為肝癌缺失基因，是YUAN等[3-4]對多種肝癌細胞系進行研究時分離得到的一種重要的抑癌基因。研究[5]表明，正常組織中DLC-1 mRNA均有表達，且啟動子無甲基化，而胃癌組織中DLC-1 mRNA呈低表達或缺失表達，且甲基化率約為35.3%。DLC-1的啟動子過甲基化與DLC-1 mRNA表達呈負相關，且DLC-1 mRNA表達缺失的胃癌組織均出現(xiàn)啟動子區(qū)過甲基化。隨著腫瘤組織分化程度降低而DLC-1 mRNA表達逐漸減弱，有淋巴結轉移的胃癌組織DLC-1 mRNA呈明顯低表達[6]?？梢奃LC-1作為一種抑癌基因，與腫瘤的分化及轉移等有密切相關性。YUAN等[4，7-9]進一步證實了啟動子區(qū)域的高甲基化可能導致肝臟、結直腸、前列腺、胃癌等多種腫瘤細胞系DLC-1基因的失活。

由于發(fā)現(xiàn)甲基化及乙?；饔镁哂锌赡嫘?，目前各地學者們將以逆轉基因甲基化及乙?；癄顟B(tài)作為治療腫瘤新的切入點[10-12]。他們成功地將5-Aza-dC運用在乳腺癌、肺癌、前列腺癌等體外培養(yǎng)的腫瘤細胞株，逆轉了Rb、VHL、p15、p16、E-cadherin等多個抑癌基因啟動子區(qū)甲基化狀態(tài)，使原本沉默的抑癌基因重新表達，進而有效地抑制了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[13-15]。研究[4]顯示，缺失DLC-1 mRNA表達的細胞系給予5-Aza-dC后DLC-1 mRNA表達明顯增強，且腫瘤細胞的生長受到明顯抑制，轉入裸鼠體內(nèi)其致瘤性也明顯降低。而組蛋白去乙?；敢种苿猅SA，可以恢復組蛋白乙?；?，對染色質結構進行修飾，有效上調抑癌基因的表達，誘導腫瘤細胞分化，阻滯腫瘤生長、細胞周期和選擇性凋亡，從而抑制多種腫瘤細胞的生長，TSA目前已應用于皮膚T淋巴細胞瘤和血液系統(tǒng)等惡性腫瘤中[16-17]。

KIM等[18]研究發(fā)現(xiàn)，5-Aza-dC及TSA單獨或聯(lián)合對人胃癌細胞有明顯的抑制作用，為了證實本實驗中5-Aza-dC及TSA單獨或聯(lián)合對人胃癌細胞SNU-1細胞的抑制作用與DLC-1基因表達上調有關，我們采用MSP及免疫熒光PCR檢測5-Aza-dC及TSA處理DLC-1啟動子區(qū)CpG島去甲基化及mRNA表達情況。實驗發(fā)現(xiàn)，胃癌SNU-1細胞株啟動子區(qū)CpG島為甲基化狀態(tài)，經(jīng)過藥物干預72 h后，5-Aza-dC能逆轉DLC-1啟動子的甲基化狀態(tài)，使因甲基化轉錄沉默的DLC-1基因恢復轉錄活性，其mRNA得以重新表達，從而發(fā)揮DLC-1的腫瘤抑制作用。而TSA對啟動子區(qū)甲基化作用無明顯影響，其mRNA表達量升高，可能與TSA恢復組蛋白乙?；蛲ㄟ^甲基化結合蛋白乙酰化，從而使轉錄失活的抑癌基因DLC-1基因mRNA重新表達。經(jīng)MSP檢測后，5-Az-dC+TSA聯(lián)合用藥與單藥5-Aza-dC作用相似，可以逆轉DLC-1基因啟動子區(qū)CpG島的甲基化狀態(tài)；而在免疫熒光PCR中，5-Aza-dC+TSA聯(lián)合用藥較5-Aza-dC單藥作用強，DLC-1基因mRNA表達量明顯升高，二者聯(lián)合具有協(xié)同作用，可能與DNA去甲基化、組蛋白乙?；ㄟ^甲基化結合蛋白相互作用有關。

總之，胃癌細胞的抑癌基因啟動子區(qū)甲基化異常的現(xiàn)象較為普遍，5-Aza-dC及TSA藥物主要針對整個基因組，而非某一個特定基因。藥物干預后可逆轉基因啟動子區(qū)異常甲基化，使其重新表達進而發(fā)揮抑癌基因的作用。DLC-1基因在胃癌SNU-1細胞系內(nèi)存在異常甲基化的現(xiàn)象，影響了該基因的正常表達，通過5-Aza-dC及TSA干預后逆轉胃癌細胞系DLC-1基因啟動區(qū)異常甲基化，提高了其mRNA表達量，發(fā)揮抑癌作用。兩藥物聯(lián)合使用后起到協(xié)同作用，增強了單藥的藥效，為5-Aza-dC及TSA應用于臨床提供了實驗基礎。

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