老年癡呆模型中人參皂苷Rg1預(yù)處理對(duì)大鼠腦片中突觸素表達(dá)的影響*

李明 李璽 權(quán)乾坤 袁海峰 徐陽(yáng)

(1.西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院, 陜西 西安 710004；2. 西安市第五醫(yī)院, 陜西 西安 710083)

老年性癡呆是一種常見于老年人的神經(jīng)退行性變性疾病。有研究表明，老年大鼠海馬突觸數(shù)量和突觸素(Synaptophysin,SYN)表達(dá)明顯減少[1]，在老年癡呆患者早期即可出現(xiàn)突觸的喪失，其認(rèn)知障礙程度與突觸結(jié)構(gòu)和功能的改變密切相關(guān)。因此，突觸的病理性重構(gòu)是老年性癡呆認(rèn)識(shí)障礙的重要病理基礎(chǔ)[2-4]。研究表明，老年大鼠腦內(nèi)突觸素丟失程度與記憶缺失程度呈正相關(guān)[5]。

人參皂甙Rg1是人參“益智延年”的主要成分, 其主要的靶器官是中樞神經(jīng)系統(tǒng)。近年來(lái)，人參皂苷Rg1對(duì)神經(jīng)保護(hù)、增強(qiáng)記憶和抗衰老作用方面的研究已取得了一定進(jìn)展[6]，已成為研究中藥抗癡呆的熱點(diǎn)之一。研究發(fā)現(xiàn)，人參皂甙Rg1對(duì)多種實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的學(xué)習(xí)記憶障礙均有明顯的改善作用，其作用機(jī)制可能與提高膽堿能功能，促進(jìn)M-膽堿受體數(shù)量明顯增加、促進(jìn)受體蛋白合成有關(guān)[7]。人參皂甙Rg1還有抗氧化，清除自由基，抗衰老和抑制細(xì)胞凋亡的作用[8-10]。但是目前關(guān)于人參皂甙Rg1對(duì)SYN表達(dá)是否有上調(diào)作用并不清楚。因此,本實(shí)驗(yàn)采用岡田酸(okadaic acid，OA)制備老年癡呆大鼠腦片模型，觀察人參皂苷Rg1對(duì)老年癡呆模型大鼠腦片中SYN表達(dá)的影響，旨在闡明人參皂苷Rg1能否通過(guò)影響突觸素的活性表達(dá)，發(fā)揮抗老年性癡呆神經(jīng)退行性變的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇體重110～130g雄性 SD大鼠,5周齡，清潔級(jí)，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK(陜)2007-001。實(shí)驗(yàn)中對(duì)動(dòng)物的處理方法符合中華人民共和國(guó)科學(xué)技術(shù)部頒發(fā)的《關(guān)于善待實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的指導(dǎo)意見》。

1.1.2 主要儀器 光學(xué)顯微鏡，日本OLYMPUS公司產(chǎn)品，型號(hào)：BH22；冰凍切片機(jī)，德國(guó)MICROM公司產(chǎn)品，型號(hào)：HM500；振動(dòng)切片機(jī)，上海之信儀器有限公司產(chǎn)品，型號(hào)：ZQP-86；圖像處理與分析系統(tǒng)，德國(guó)LEICA公司產(chǎn)品，型號(hào)：Qwin550CW。

1.1.3藥物與試劑 人參皂苷Rg1購(gòu)自吉林宏久生物科技股份有限公司，分子式為C42H72O14,化學(xué)結(jié)構(gòu)式見圖1，純度98.99%，使用前溶于分析純甲醇。OA購(gòu)自美國(guó)ALEXIS生物制劑公司，純度98%，使用前溶于10% 二甲基亞砜(dimethy sulphoxide, DMSO)，配制成1 mg/mL二甲亞砜溶液待用。SYN蛋白兔抗鼠多克隆抗體、免疫組化試劑盒(SABC)及DAB均為北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。Haws’S蘇木素由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心提供。

圖1 人參皂苷Rg1分子結(jié)構(gòu)示意圖Figure 1 The chemical structural formula of Gensenoside Rg1

1.2 方法

1.2.1 腦片制備 配置人工腦脊液(成分：mmol·L-1)(150 NaCl，2 CaCl2，1.2 MgSO4，0.5 KH2PO4，1.5 K2HPO4，10 glucose，pH7.4) ，取5周齡SD大鼠，參照文獻(xiàn)方法[11]，大鼠經(jīng)6%水合氯醛麻醉后，斷頭取腦，快速置于0～4 ℃的人工腦脊液冰水混合物中，振動(dòng)切片機(jī)以振幅8檔，速度3檔行冠狀切片所切腦片含皮層和海馬，平均厚度400μm。挑選形態(tài)較好(含海馬和皮層)的腦片置入盛有人工腦脊液的6孔板中培養(yǎng)，溫度(32.0±0.5)℃，整個(gè)過(guò)程人工腦脊液中持續(xù)通入混合氧氣(95%O2+5%CO2)。

1.2.2 分組及干預(yù) 腦片隨機(jī)分為5組：空白組、模型組、人參皂苷Rg1低、中、高濃度組，每組10張腦片。人工腦脊液孵育1小時(shí)，人參皂苷Rg1各組分別加入人參皂苷Rg1(60 μmol·L-1、120 μmol·L-1、240 μmol·L-1)培養(yǎng)2 h，模型組和人參皂苷Rg1各濃度組分別加入OA(1 μmol·L-1)培養(yǎng)3 h后，固定處理。

1.2.3 腦片SYN表達(dá)檢測(cè) 標(biāo)本經(jīng)4%多聚甲醛固定4 h，取出，轉(zhuǎn)入30%蔗糖溶液浸泡至沉底，做冰凍切片，切片10μm厚，每張切片含皮層、海馬、齒狀回。然后進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，組織切片經(jīng)抗原修復(fù), 3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶10 min, 兔抗大鼠SYN濃度為1:600, 4℃過(guò)夜,生物素標(biāo)記的單克隆小鼠抗兔IgG即用型二抗和SABC試劑各在室溫下作用30 min, 鏈酶親和素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物進(jìn)行抗原修復(fù)，最后DAB顯色,蘇木素輕度復(fù)染, PBS代替一抗做陰性對(duì)照。

1.2.4 圖象分析 采用圖象處理與分析系統(tǒng)，檢測(cè)陽(yáng)性反應(yīng)物質(zhì)的平均灰度值，每張切片同一區(qū)域中，隨機(jī)選取6個(gè)視野，檢測(cè)面積相同，取其平均值作為該切片目標(biāo)區(qū)域的平均灰度值。灰度值越低，蛋白表達(dá)量越高，反之灰度值越高，蛋白表達(dá)量越低。

2 結(jié)果

SYN的陽(yáng)性免疫反應(yīng)物質(zhì)為棕黃色，主要分布于細(xì)胞的突觸、胞膜和胞漿，胞核不著色或著色淡。本實(shí)驗(yàn)中，大鼠腦片經(jīng)岡田酸孵育后，模型組與空白組比較，SYN的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量明顯減少(P<0.05)。經(jīng)人參皂苷Rg1干預(yù)后檢測(cè)腦片SYN的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，各濃度藥物組SYN的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量均有增加(P<0.05)，其中低劑量組與中劑量組在CA1和Cortex之間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，同時(shí)在各腦區(qū)人參皂甙Rg1高劑量組SYN的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯優(yōu)于人參皂甙Rg1中、低劑量組，存在一定的劑量依賴關(guān)系，見表1、圖2。

表1 人參皂甙Rg1對(duì)老年癡呆模型大鼠腦片SYN的影響(灰度值)Table 1 Expression of SYN protein in rat brain slices in different groups

注：與空白組比較，①P<0.05；與模型組比較，②P<0.05；與高劑量組間比較，③P<0.05；與中劑量組比較，④P<0.05

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組大鼠腦片皮層區(qū)SYN蛋白陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)(光學(xué)顯微鏡，×400)Figure 2 Expression of SYN protein in cortex in different groups observed by immunohistochemical method注：A. 空白組； B. 模型組； C. 人參皂甙Rg1高濃度組

3 討論

突觸素是突觸小泡中含量最多的特異性膜通道蛋白，在所有的神經(jīng)末梢內(nèi)幾乎都有分布,是神經(jīng)元和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的一種特異性標(biāo)記物。它在突觸囊泡的導(dǎo)入、轉(zhuǎn)運(yùn)、再循環(huán)和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放及突觸的發(fā)生和發(fā)育，以及突觸的可塑性中都具有非常重要的作用，是學(xué)習(xí)記憶過(guò)程中的重要蛋白[12-13]。突觸素分布數(shù)量和密度可間接反映突觸的數(shù)量和密度[14]。突觸喪失將會(huì)引起嚴(yán)重的認(rèn)知障礙,學(xué)習(xí)記憶功能受損[15]。因此，免疫組化圖像采集及數(shù)據(jù)分析能反映神經(jīng)元突觸變化狀況。本實(shí)驗(yàn)將岡田酸加入培養(yǎng)大鼠腦片的ACSF中結(jié)果發(fā)現(xiàn),與空白組比較,模型組SYN蛋白陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞量下降(P<0.05) ,推測(cè)可能是岡田酸造成大鼠腦片神經(jīng)元變性壞死,導(dǎo)致軸突終末變性、丟失，突觸數(shù)量及突觸素表達(dá)的降低，這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[16]。

人參皂苷 Rg1 作為人參促智作用的主要有效成份之一，對(duì) AD 具有多種神經(jīng)保護(hù)作用[17-21]。目前還未有研究證實(shí)人參皂苷 Rg1 是否可以通過(guò)上調(diào)腦內(nèi)SYN表達(dá)在突觸的可塑性中起一定的作用。本實(shí)驗(yàn)在ACSF中首先加入人參皂苷Rg1預(yù)處理2 h,然后再加入岡田酸,結(jié)果發(fā)現(xiàn),人參皂苷Rg1各組腦片SYN蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)較模型組顯著提高(P<0.05)。這說(shuō)明人參皂苷Rg1可能通過(guò)對(duì)抗岡田酸對(duì)SYN的抑制作用, 上調(diào)SYN的蛋白表達(dá)水平，且表達(dá)隨劑量的增加而增加,人參皂苷Rg1藥效作用呈一定的劑量依賴關(guān)系。

總之，人參皂苷 Rg1對(duì)OA所致AD大鼠腦片有明顯的干預(yù)作用,這種作用可能與人參皂苷 Rg1提高腦片突觸素的陽(yáng)性表達(dá)、增加神經(jīng)元保護(hù)有關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

本文結(jié)果顯示，以O(shè)A誘導(dǎo)大鼠腦片tau蛋白發(fā)生磷酸化，制備AD樣tau蛋白磷酸化大鼠腦片模型，經(jīng)人參皂苷Rg1預(yù)處理后，SYN的陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)明顯增加且呈劑量依賴關(guān)系。由此可見，人參皂苷Rg1通過(guò)上調(diào)腦內(nèi)SYN的表達(dá)，增加神經(jīng)元保護(hù)，以此發(fā)揮抗癡呆作用。

【參考文獻(xiàn)】

[1]姚柏春，鄧兆宏，孫天敏，等.AB1-40 誘導(dǎo)大鼠海馬突觸體素和突觸數(shù)量的變化[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2007,17(12):153.

[2]Zhong GS, Ruan DY,Ge SY,etal. Effects of lithium on the synaptic plasticity in dentate gyrus region of rat hippocampus[J].Chin J Pharmacol-Toxicol，2002,16(6):432-437.

[3]Arendt T.Alzheimer`s disease as a disorder of dynamic brain self-organization [J].Prog Biain Res,2005,147:355-378.

[4]Spires TL,Hyman BT. Neuronal structure is altered by anryloid plaques[J].Res Neurosci,2004,15(4),267-278.

[5]Head E, Corrada M M,Kahle-Wrohleski K,etal.Synaptic proteins, neuropathology and cognitive status in the oldest-old[J].Neurobiol Aging,2009,30(7):1125-1134.

[6]Zhang JT. Nootropic mechanisms of ginsenoside Rg1 influence on neuronal plasticity and neurogenesis[J]. Yao Xue Xue Bao, 2005; 40(5): 385-388.

[7]Zhang JT,Qu ZW,and Liu Y,etal.Preliminary study on antiamnestic mechanism of ginsenoside Rg1 and Rb1[J].Chin Med J,1990, 103(11):932-938.

[8]Chen XC,Fang F,Zhu YG,etal. Protective effect of ginsenoside Rg1 on MPP+-induced apoptosis in SHSY5Y cells[J].J Neural Transm,2003,110(8):835-845.

[9]金建生，趙朝暉，陳曉春,等.人參皂甙Rg1抗衰老作用可能與改變p21、cyclin E、CDK2的表達(dá)有關(guān)[M]，中國(guó)臨床藥理學(xué)與治療學(xué)，2004，9(1)：29-36.

[10] Chen XC,Zhu YG,and Zhu LA,etal.Ginsenoside Rg1 attenuates dopamine-induced apoptosis in PC12 cells by suppressing oxidative stress[J].Eur J Pharmacol,2003,18,473(1):1-7.

[11] Gong CX, Lidsky T, Wegiel J,etal. Metabolically active rat brain slices as a model to study the regulation of protein phosphorylation in mammalian brain[J]. Brain Res Protoc, 2001,6(3): 134-140.

[12] Lippa CF. Synaptophysin immunoreactivity in Pick' s disease: comparison with Alzheimer's disease and dementia with Lewy bodies[J]. Am J Alzheimers Dis Other Demen,2004, 19( 6) : 341-344.

[13] Guevara J，Dilhuydy H，Espinosa B，etal. Coexistence of reactive plasticity and neuron degeneration in Alzheimer diseased brains[J]. Histol Histopathol，2004,19( 4) : 1075-1084.

[14] Boncristiano S, Calhoun ME, Howard V,etal. Neocortical synaptic bouton number is maintained despite robust amyloid deposition in APP23 transgenic mice[J]. Neurobiol Aging, 2005, 26(5): 607-613.

[15] Walsh DM，Selkoe DJ. Deciphering the molecular basis of memory failure in Alzheimer's disease[J]. Neuron，2004, 44( 1) : 181-193.

[16] Tenna,YuanH.The mystery of Alzheimer's disease and its prevention by melatonin[J].Med Hypotheses,2004,12(5):233-244.

[17] Liu QA，Kou JP，Yu BY．Ginsenoside Rg1 protects against hydrogen peroxide-induced cell death in PC12 cells via inhibiting NF-kappa B activation[J]．Neurochemistry International，2011,58(1):119-125.

[18] Chen XC，Chen Y，Zhu YG，etal. Protective effect of ginsenoside Rg1 against MPTP-induced apoptosis in mouse substantia nigra neurons[J]. Acta Pharmacologica Sinica，2002,23(9):829-834.

[19] Gong L，Li SL，Li H，etal．Ginsenoside Rg1 protects primary cultured rat hippocampal neurons from cell apoptosis induced by beta beta-amyloid protein [J]. Pharmaceutical Biology，2011,49(5):501-507.

[20] Mook-Jung I，Hong H S，Boo J H，etal. Ginsenoside Rb1 and Rg1 improve spatial learning and increase hippocampal synaptophysin level in mice [J]．Journal of Hepatology，2009，49(2)：646-657.

[21] Peng XS, Cheng XC, Huang JS,etal. The effect of ginsenoside Rg1 on abnormal phosphorylation of tau in rat shippocampal neurons induced by aggregated Aβ25-35[J]. Zhongguo Yao Li Xue Tong Bao,2005,21(3):299-305.