牡荊素保護(hù)DNA氧化損傷的活性評價(jià)及機(jī)制分析

陳 班 李達(dá)歡 - 李熙燦 -

(廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006)

由活性氧 (Reactive Oxygen Species, ROS)引起的DNA氧化損傷，可以導(dǎo)致細(xì)胞的氧化應(yīng)激，引起基因突變、癌變以及神經(jīng)退行性病變[1]。羥自由基 (·OH)為ROS中最具殺傷力的自由基，既可以進(jìn)攻DNA中的鳥嘌呤堿基，生成8-羥基-2′-脫氧鳥嘌呤核苷(8-hydroxy-2′-deoxyguanosine，8-OHdG)，也可以進(jìn)攻脫氧核糖骨架，生成丙二醛(malondialdehyde，MDA)等產(chǎn)物。8-OHdG與MDA，均是細(xì)胞氧化應(yīng)激的毒性產(chǎn)物[2]。所以， 8-OHdG 已作為重要生物標(biāo)識物，用于DNA氧化損傷相關(guān)疾病的篩查[3]。而臍帶血中的MDA含量的檢測，可用于判斷早產(chǎn)兒的氧化應(yīng)激狀況與DNA損傷的水平[4]。因此，尋找合適的抗氧化劑，保護(hù)DNA免受氧化損傷，減少相關(guān)毒性產(chǎn)物的生成，已成為自由基生物醫(yī)學(xué)研究的一項(xiàng)重要內(nèi)容。

前期的研究[5]表明，食用植物中的抗氧化成分主要為多酚類化合物。可食用的多酚主要有黃酮及黃酮苷、類黃酮、雙黃酮等，其中以黃酮及黃酮苷最常見。牡荊素(vitexin, apigenin-8-C-glucoside)是一種典型的黃酮類化合物(圖1)，存在于山楂等可食用植物中。據(jù)文獻(xiàn)[6]報(bào)道，山楂葉的牡荊素含量為0.04～0.06 mg/g。含有牡荊素的山楂葉總黃酮有抗心肌缺血及再灌注損傷、降低血脂等藥理活性，這些藥理活性與總黃酮的抗氧化性均有直接關(guān)聯(lián)[7]。

此前，一些零星報(bào)道[8-10]提及牡荊素的抗氧化作用，不過，尚未涉及牡荊素對DNA氧化損傷的修復(fù)(或保護(hù))活性。本試驗(yàn)擬采用DNA保護(hù)能力分析法，研究牡荊素的DNA保護(hù)能力；運(yùn)用Ferrozine法和紫外可見光譜(UV-Vis)法，分析其Fe2+絡(luò)合反應(yīng)；運(yùn)用Cu2+還原法，測定其電子轉(zhuǎn)移ET(Electron-transfer)能力。在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步闡釋牡荊素保護(hù)DNA氧化損傷可能的化學(xué)機(jī)制，為牡荊素應(yīng)用于DNA氧化損傷相關(guān)疾病的防治提供依據(jù)。

圖1 牡荊素結(jié)構(gòu)式Figure 1 The structure of vitexin

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

牡荊素(CAS：3681-93-4)：HPLC≥98%，四川省維克奇生物科技有限公司；

Trolox(水溶性維生素E)、BHA(丁基羥基茴香醚)、Ferrozine(菲洛嗪)、Neocuproine(新銅試劑)：分析純，西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司；

ABTS(2’-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)、魚精DNA鈉鹽：分析純，美國Amresco公司；

KH2PO4、Na2HPO4、Na2EDTA、FeCl3、CuSO4、H2O2、DMSO(二甲基亞砜)、三氯乙酸、2-硫代巴比妥酸、抗壞血酸、檸檬酸鈉、乙酸銨、甲醇、乙醇：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

1.1.2 主要儀器設(shè)備

可見分光光度計(jì)：2100型，上海尤尼科儀器有限公司；

電子天平：BS110S型，北京賽多利斯科學(xué)儀器有限公司；

超聲波清洗機(jī)：SB3200D型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

便攜式pH計(jì)：YSI pH100型，上海維賽儀器貿(mào)易有限公司；

恒溫水浴鍋：DZKW型，北京市永光明醫(yī)療儀器廠；

電熱恒溫鼓風(fēng)干燥器：DHG-9070A型，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 方法

1.2.1 DNA保護(hù)能力分析法 參考文獻(xiàn)[11]修改如下，取適量(0，100，150，200，250，300 μL)牡荊素溶液(2 mg/mL，DMSO溶解)至離心管中，揮干溶劑，往其中加入300 μL的KH2PO4/Na2HPO4緩沖溶液(0.2 mol/L，pH=7.4)和100 μL Na2EDTA溶液(0.25 mmol/L)。隨后，依次加入50 μL FeCl3溶液(1.6 mmol/L)，75 μL的H2O2溶液(16.8 mmol/L)和50 μL底物DNA溶液(5 mg/mL魚精DNA鈉鹽)。再加入75 μL抗壞血酸溶液(33.6 mmol/L)，補(bǔ)加緩沖溶液，使反應(yīng)液總體積達(dá)到1 050 μL，搖勻，將該離心管置于50 ℃水浴中20 min，取出，再加入250 μL三氯乙酸溶液(100 mg/mL)和150 μL 2-硫代巴比妥酸溶液(50 mg/mL)，于105 ℃烘箱中加熱15 min，在532 nm處測定其吸光度值A(chǔ)。試驗(yàn)以Trolox和BHA為陽性對照。按式(1)計(jì)算牡荊素對DNA的保護(hù)率R。

(1)

式中：

R——DNA保護(hù)百分率，%；

A0——未加樣品的溶液吸光度；

A——加入樣品后溶液的吸光度。

1.2.2 Ferrozine法 參考文獻(xiàn)[11]修改如下：取FeCl2溶液(250 μmol/L) 0.1 mL，加適量(0，400，600，1 200，1 600，2 000 μL)牡荊素(0.01 mg/mL，DMSO 溶解)溶液，充分混合后靜置3 min，再加入0.8 mL甲醇，0.15 mL Ferrozine (500 μmol/L)溶液，靜置5 min后，在562 nm下測定吸光度值A(chǔ)。按式(2)計(jì)算牡荊素對Fe2+絡(luò)合率C。

(2)

式中：

C——Fe2+絡(luò)合百分率，%；

A0——未加樣品的溶液吸光度；

A——加入樣品后溶液的吸光度。

1.2.3 Fe2+絡(luò)合產(chǎn)物UV-Vis光譜分析 參考文獻(xiàn)[12]修改如下：取樣品溶液(1 mg/mL，DMSO溶解)100 μL，加入100 mg/mL FeCl2溶液300 μL，再加入甲醇水(1∶1)600 μL。在反應(yīng)0，5，10，20，30，40，50，60，120 min時(shí)進(jìn)行UV-Vis光譜掃描。最后對反應(yīng)液、樣品液和FeCl2溶液進(jìn)行顏色對比。

1.2.4 Cu2+還原法 參考文獻(xiàn)[11]修改如下：取10 mmol/L CuSO4溶液和7.5 mmol/L新銅試劑各125 μL混勻，依次加入牡荊素溶液(0.5 mg/mL，DMSO溶解)xμL(x=150，200，250，300，350)，0.1 mol/L乙酸銨緩沖液(700-x) μL，混合后靜置30 min，在450 nm下測吸光度值A(chǔ)。按式(3)計(jì)算牡荊素對Cu2+相對還原率S。

(3)

式中：

S——Cu2+的相對還原百分率，%；

A0——未加樣品液時(shí)所測吸光度；

Amax——一次測量內(nèi)最大的吸光度；

A——加入樣品液時(shí)所測吸光度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA保護(hù)能力及機(jī)制

由于·OH進(jìn)攻DNA的脫氧核糖部分會生成MDA等毒性物質(zhì)，從而導(dǎo)致多種疾病的發(fā)生[13-15]。因此，抑制MDA的生成，可有效保護(hù)DNA免受氧化損傷。通過檢測MDA與2-硫代巴比妥酸形成的硫代巴比妥酸反應(yīng)產(chǎn)物(thiobarbituric acid reactive substances, TBARS)復(fù)合物的含量，可以檢測MDA的存在。TBARS在532 nm處有最大吸收。如果A532 nm值降低，則表明MDA的生成得到了有效抑制，DNA在一定程度上受到保護(hù)。因此，該模型可用來評估DNA氧化損傷的程度。如圖2(a)所示，在0～0.6 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，牡荊素的DNA保護(hù)能力與其濃度呈現(xiàn)出良好的量效關(guān)系。從表1可以看出，其DNA保護(hù)能力約為Trolox的2.50倍。這表明，牡荊素能保護(hù)DNA免受·OH誘導(dǎo)的氧化損傷。

表1 各個檢測指標(biāo)下樣品和陽性對照的IC50值?Table 1 The IC50 values of vitexin and the positive controls

?IC50指被測量的拮抗劑的半抑制濃度；同行不同上標(biāo)字母表示數(shù)據(jù)有顯著差異(P<0.05)；比值指相應(yīng)指標(biāo)下水溶性維生素E或檸檬酸鈉的IC50與牡荊素的IC50之比；N.D.指不需測。

圖2 牡荊素抗氧化作用的量效關(guān)系圖Figure 2 The dose response curves of vitexin in various antioxidant assays

2.2 Fe2+絡(luò)合活性及機(jī)制

據(jù)文獻(xiàn)[16]報(bào)道，在H2O2對酒石酸的氧化過程中，F(xiàn)e2+可以極大提高反應(yīng)速率，后通過順磁共振試驗(yàn)(ESR)證實(shí)，在此反應(yīng)體系中，·OH是實(shí)際的氧化中間體。在沒有金屬離子存在時(shí)，DNA能對抗?jié)舛燃s10 mmol/L的H2O2[17]，但只要有皮克級的Fe2+參與反應(yīng)，就能夠使H2O2轉(zhuǎn)化成·OH，從而引起DNA 的氧化損傷[18]。在細(xì)胞中，這種催化作用通過Fenton反應(yīng)(Fe2++H2O2→Fe3++·OH+·OH-)實(shí)現(xiàn)[12,19-22]。因此，絡(luò)合Fe2+可以有效地減少·OH 的生成，從而保護(hù)DNA免受·OH誘導(dǎo)的氧化損傷，使細(xì)胞能健康成長甚至分化[23]。

從圖2(b)中可以看出，在0～7 μg/mL的濃度范圍內(nèi)，牡荊素對Fe2+的絡(luò)合能力與其濃度呈現(xiàn)劑量相關(guān)性。據(jù)表1可知，牡荊素、檸檬酸鈉的鐵絡(luò)合能力的IC50值分別為(9.3±1.2)，(9.6±2.8) μmol/L，二者沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，表明兩者的鐵絡(luò)合能力相似。從圖3(a)可知，絡(luò)合產(chǎn)物在200～400 nm 的波長范圍內(nèi)，其紫外吸收強(qiáng)度有一定程度的增加。從圖3(b)可以看出，牡荊素在與Fe2+混合的60 min 與120 min 的吸收強(qiáng)度很接近(線條⑧和⑨)，說明該反應(yīng)在60 min時(shí)已基本達(dá)到平衡。而在二者混合的瞬間(0 min)，即在554 nm處生成新的吸收峰(線條①)，其強(qiáng)度已超過120 min時(shí)(線條⑨)吸收強(qiáng)度的50%，說明牡荊素的Fe2+絡(luò)合反應(yīng)是一個快速反應(yīng)。此時(shí)，牡荊素樣品溶液由淡黃色變成了黃綠色，其554 nm處摩爾吸光系數(shù)ε=2 680.74 L/(mol·cm)?？傊?，牡荊素對Fe2+有一定的絡(luò)合作用，該絡(luò)合作用可能是牡荊素保護(hù)DNA免受氧化損傷的機(jī)制之一。

牡荊素絡(luò)合Fe2+的能力，與其分子結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)有關(guān)。牡荊素分子的4-羰基和5-羥基為共平面構(gòu)型，F(xiàn)e2+易在此處構(gòu)成一個平面的環(huán)狀結(jié)構(gòu)。因此，牡荊素可能在4-羰基-5-羥基之間存在一個Fe2+絡(luò)合位點(diǎn)，其絡(luò)合反應(yīng)式見圖4。由圖4 可知，F(xiàn)e2+在4-羰基-5-羥基之間形成了一個六元環(huán)，由于六元環(huán)的角張力最小，所以，其Fe2+絡(luò)合的片段結(jié)構(gòu)是穩(wěn)定的，與此前的一些報(bào)道[18,19,22,24]相吻合。綜上，牡荊素的Fe2+絡(luò)合能力得益于其環(huán)狀的結(jié)構(gòu)。對于一些鏈狀的脂肪酸(如十六酸)而言，則不可能與Fe2+絡(luò)合[25-26]；而對于一些環(huán)狀的倍半萜內(nèi)酯(如白術(shù)內(nèi)酯[27])而言，由于沒有環(huán)外的羰基或羥基，同樣不能表現(xiàn)出Fe2+絡(luò)合活性。這反過來印證了：牡荊素絡(luò)合Fe2+的能力，與分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)(特別是平面構(gòu)型的4-羰基-5-羥基)相關(guān)。

①～⑨ 分別為0.1 mg/mL牡荊素與30 mg/mL Fe2+絡(luò)合0，5，10，20，30，40，50，60，120 min后的掃描結(jié)果; ⑩ 為0.1 mg/mL牡荊素溶液掃描結(jié)果；為30 mg/mL FeCl2溶液掃描結(jié)果

圖3 牡荊素與Fe2+絡(luò)合產(chǎn)物的UV光譜圖及Vis光譜圖

Figure 3 The UV-spectra and Vis-spectra of vitexin

binding to Fe2+complexing

圖4 牡荊素絡(luò)合Fe2+的可能反應(yīng)Figure 4 The possible reaction of vitexin complexing with Fe2+

2.3 Cu2+還原活性及機(jī)制

由圖2(c)可知，在0.00～0.16 mg/mL的濃度范圍內(nèi)，牡荊素對Cu2+的還原能力與其濃度呈現(xiàn)出良好的劑量相關(guān)性。這表明牡荊素具有一定的Cu2+還原能力。而Cu2+還原本質(zhì)是一個電子轉(zhuǎn)移的過程[16-18]，因此，在牡荊素保護(hù)DNA免受·OH誘導(dǎo)的氧化損傷的過程中，可能涉及到電子轉(zhuǎn)移。

3 結(jié)論

牡荊素具有良好的保護(hù)DNA免受·OH誘導(dǎo)的氧化損傷的能力。其保護(hù)機(jī)制可能與電子轉(zhuǎn)移及Fe2+絡(luò)合有關(guān)。其Fe2+絡(luò)合反應(yīng)的位點(diǎn)，可能在4-羰基-5-羥基之間。這些抗氧化化學(xué)機(jī)制的闡釋，將推動牡荊素在DNA氧化損傷相關(guān)的疾病方面發(fā)揮作用。

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