文丘里管空化對殼聚糖微球制備及抑菌劑包埋的影響

張昆明 - 陸小菊 - 黃永春 -

黃承都1,2,3HUANG Cheng-du1,2,3 楊 鋒1,2,3YANG Feng1,2,3 黃 瓊1,2,3HUANG Qiong1,2,3

殼聚糖(Chitosan, CS)是由甲殼素(Chitin)經脫乙酰化后得到的一種帶正電荷的天然聚陽離子弱堿性多糖[1]，具有優(yōu)異的生物相容性、可降解性和生物黏附性等，且安全無毒[2]，因而在化工、食品、生物和醫(yī)藥領域常被加工制作成支架、微球或納米粒的形式，并作為活性載體用來包埋負載一些有價值的多肽[3]、酶蛋白[4]、維生素[5]、氨基酸[6]、胰島素[7]和抗癌藥物[7]等。殼聚糖微球或其納米粒的制備一直是殼聚糖資源高值化加工與利用的研究熱點[5,8-9]。

本課題組研究[22-23]表明，渦流空化可用于強化離子交聯法制備殼聚糖微球這一物理過程，并取得了很理想的結果。本研究在前期工作的基礎上，以甲基異噻唑啉酮(MIT)為模型抑菌劑，探討了一種新的空化方式——基于文丘里管的水力空化對離子交聯法制備殼聚糖微球及包埋MIT的影響，并和傳統基于機械攪拌的離子交聯法制備殼聚糖微球進行比較，以期為文丘里管空化強化離子交聯法制備殼聚糖微球提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

殼聚糖(CS)：脫乙酰度為86.6%，分子量為50～90 kDa，上海市卡博工貿有限公司；

冰醋酸、三聚磷酸鈉(TPP)、氫氧化鈉：分析純，柳州市益嘉化工有限公司；

甲基異噻唑啉酮(MIT)：質量分數10%，湖北巨勝科技有限責任公司；

試驗用水：去離子水，電導率≤ 4 μs/cm，自制。

1.1.2 主要儀器設備

文丘里管空化元件：自行研制；

電子分析天平：ISO9001型，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；

pH計：PE20型，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；

自動雙重純水蒸餾器：SZ-93型，上海精密儀器儀表有限公司；

精密增力電動攪拌器：JJ-1型，江蘇常州國華電器有限公司；

冷凍高速離心機：J-26 XPI 型，美國Beckman Coulter公司；

紫外分光光度計：Cary 60型，美國Agilent Technologies 公司。

1.2 方法

1.2.1 試驗裝置與流程 文丘里管空化試驗裝置見圖1。試驗操作步驟：稱取適量的殼聚糖緩慢倒入pH 4.0的醋酸溶液中，邊加邊攪拌至大部分固體溶解后，靜置1.0 h，使殼聚糖充分溶解，用雙層濾布除去不溶性雜質。配制并量取所需濃度的MIT溶液500 mL和TPP溶液400 mL，并將二者充分混勻。將配制好的殼聚糖溶液取1.0 L倒入空化試驗裝置的料液貯槽1中，開啟驅動泵2，調節(jié)閥門V2和V3控制文丘里管3的入口壓力，并通過壓力計P1、P2分別監(jiān)測文丘里管的入口壓力、出口壓力，同時開啟冷凝水通過恒溫水槽5，控制反應溫度保持在35 ℃，在達到所需的入口壓力后，將MIT和TPP的混合液加入到料液槽1中，每隔一段時間在料液槽1中可收集得到文丘里管空化制備包埋MIT抑菌劑的殼聚糖微球。

1. 料液槽 2. 驅動泵 3. 文丘里管 4. 流量計 5. 恒溫水槽 V1、V2、V3. 閥門 P1、P2. 壓力計

圖1 文丘里管空化試驗裝置圖

Figure 1 Schematic presentation of experimental set-up for venturi-based HC

本試驗采用的文丘里管結構見圖2。入口直徑D1為15.0 mm，出口直徑D2為20.0 mm，進出口段長度l為35.0 mm，收縮段長度a為10.2 mm，喉管段長度b為12.0 mm，擴張段長度c為18.0 mm，喉管直徑d為3.2 mm，入口錐角α為30°，出口錐角β為25°。

1.2.2 文丘里管空化與機械攪拌法對比試驗設計 傳統離子交聯法制備殼聚糖微球時采取的機械攪拌轉速通常為300～900 r/min[24-25]。本試驗在固定殼聚糖濃度3.0 g/L，TPP濃度3.0 g/L，MIT濃度0.5 mmol/L的條件下，分別選取機械攪拌器的轉速為360，900 r/min，文丘里管空化制備微球時選取空化入口壓力為0.2 MPa，比較在2種制備方式下不同反應時間對殼聚糖微球包封率的影響。

圖2 文丘里管結構示意圖Figure 2 Schematic diagram ofventuri structure

1.2.3 單因素試驗設計

(1) 空化入口壓力對微球包封率的影響：在空化時間20 min，殼聚糖濃度3.0 g/L，TPP濃度2.0 g/L，MIT濃度0.5 mmol/L 的條件下，考察空化入口壓力(0.05，0.10，0.15，0.20，0.30，0.40，0.50 MPa)對微球包封率的影響。

(2) 空化時間對微球包封率的影響：在空化入口壓力0.20 MPa，殼聚糖濃度3.0 g/L，TPP濃度2.0 g/L，MIT濃度0.5 mmol/L的條件下，考察空化時間(5，10，15，20，25 min)對微球包封率的影響。

(3) 殼聚糖濃度對微球包封率的影響：在空化入口壓力0.20 MPa，空化時間20 min，TPP濃度2.0 g/L，MIT濃度0.5 mmol/L 的條件下，考察殼聚糖溶液濃度(1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 g/L)對微球包封率的影響。

(4) 殼聚糖和TPP的質量比對微球包封率的影響：在空化入口壓力0.20 MPa，空化時間20 min，殼聚糖濃度3.0 g/L，MIT濃度0.5 mmol/L的條件下，考察TPP濃度(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5，4.0 g/L；即殼聚糖和TPP的質量比分別為7.500∶1，5.000∶1，3.750∶1，3.000∶1，2.500∶1，2.140∶1，1.875∶1)對微球包封率的影響。

(5) MIT濃度對微球包封率的影響：在空化入口壓力0.20 MPa，空化時間20 min，殼聚糖濃度3.0 g/L，TPP濃度3.0 g/L的條件下，考察MIT濃度(0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.8，1.0 mmol/L)對微球包封率的影響。

1.2.4 微球包封率的測定 根據劉寶彪等[22]的方法，修改如下：取10.0 mL制備好的殼聚糖-甲基異噻唑啉酮(CS-MIT)微球膠體液，加入2.0 mL 2.0 mol/L NaOH溶液使未反應的殼聚糖及微球沉淀，于8 000 r/min離心10 min，取上清液，在波長273 nm下測定吸光度，計算游離的MIT濃度。包封率按式(1)計算：

(1)

式中：

EE——包封率，%；

m1——反應前總的MIT量，mmol；

m2——空化反應后游離的MIT量，mmol。

2 結果與分析

2.1 文丘里管空化與機械攪拌比較

由圖3可知，文丘里管空化制備微球的包封率顯著高于傳統機械攪拌法制備微球的包封率，一方面是由于機械攪拌主要是通過攪拌過程提供的剪切力作用實現殼聚糖、TPP和MIT三者間的混合，屬于宏觀層次上的混合過程，而水力空化主要是依賴于殼聚糖、TPP和MIT三者混合液中易揮發(fā)的溶劑組分(即：水分子)形成的空化泡在潰滅瞬間產生的機械效應實現混合，屬于微觀層次上的混合過程[6,11]，促進了殼聚糖分子與TPP分子之間的物理交聯作用；另一方面由于文丘里管空化可在大范圍內形成一個比較均勻的空化場，殼聚糖、TPP和MIT三者空化混合后在流場中的濃度分布更加均勻，所形成的殼聚糖微球顆粒大小分布更窄，擁有更大的比表面積，對MIT包埋的效果更好。在交聯反應時間為20 min時，機械攪拌和文丘里管空化制備的微球包封率均達到了最大，其中360，900 r/min 2種攪拌轉速下微球的包封率分別為33.4%，44.6%，而文丘里管空化下微球的包封率為62.3%，比2種攪拌轉速下的微球包封率分別高了28.9%，17.7%，說明殼聚糖分子與TPP分子二者間的物理交聯作用已趨于平衡，且文丘里管空化法優(yōu)于機械攪拌法制備殼聚糖微球。在交聯反應超過20 min，文丘里管空化和機械攪拌制備的微球包封率均呈現了降低的趨勢，是由于達到平衡后的微球間相互碰撞，同時受到空化的“熱點”效應或機械攪拌產生的剪切作用使微球自身發(fā)生破碎，使包埋的MIT重新釋放到溶液中。以上研究結果證實，和基于傳統機械攪拌的離子交聯法制備殼聚糖微球相比，文丘里管空化能有效強化該法在制備殼聚糖微球中對MIT抑菌劑的包埋效果，這和劉寶彪等[22]采用渦流空化制備載藥殼聚糖微球的結果相一致。

圖3 文丘里管空化與機械攪拌試驗結果Figure 3 Comparative results between venturi-based cavitation and mechanical agitation

2.2 單因素試驗

2.2.1 空化入口壓力對微球包封率的影響 由圖4可知，隨著空化入口壓力的增大，微球對MIT抑菌劑的包封率呈先增大后減小的趨勢。這主要是隨著空化入口壓力的增大，液體通過文丘里管的流速增大，空化數減小，空化效應增強，加劇了殼聚糖、TPP和MIT三者間的混勻程度，促進了殼聚糖分子與TPP分子間的靜電物理交聯作用，使微球更易形成，對MIT抑菌劑包埋的量也隨之增大；但當入口壓力繼續(xù)增大，液體中的氣泡經過文丘里管空化區(qū)的速度加快，促使氣泡生長和進入壓力恢復區(qū)域的時間縮短，造成空化泡未充分發(fā)育成足夠大的氣泡就發(fā)生潰滅，導致潰滅時釋放的能量降低，空化效果變差[11]，從而造成微球對MIT包埋的效果變差。在入口壓力為0.20 MPa時，微球的包封率達到最大(57.6%)。因此，選擇適宜的空化入口壓力為0.20 MPa。

2.2.2 空化時間對微球包封率的影響 由圖5可知，隨著空化時間的延長，微球對MIT抑菌劑的包封率呈逐漸增大的趨勢，并在空化時間延長至20 min時，包封率增至最大為57.6%，繼續(xù)延長空化時間，包封率呈迅速降低的趨勢。這一變化趨勢與2.1中對比試驗的空化試驗結果相一致。因此，選取的適宜空化時間為20 min。

2.2.3 殼聚糖濃度對微球包封率的影響 由圖6可知，隨著殼聚糖濃度的增大，微球對MIT抑菌劑的包封率呈顯著增大的趨勢，并在殼聚糖濃度增大至3.0 g/L時，包封率增至最大為57.6%，此時繼續(xù)提高殼聚糖濃度，包封率呈降低趨勢。這是由于當殼聚糖濃度較低時，增大殼聚糖濃度相當于提高了反應物濃度，增大了殼聚糖分子與交聯劑TPP分子交聯的幾率，從而使生成微球的數量增多，對MIT抑菌劑包埋的量也隨之增大；但當殼聚糖濃度繼續(xù)增大時，由于殼聚糖的醋酸水溶液屬于非牛頓假塑型流體，其黏度會進一步加大，此時空化泡膨脹生成過程中所需克服液體分子間的作用力也隨之增大，因而空化核較難產生，在相同的空化入口壓力下，空化泡難以生長成足夠大的氣泡，從而空化振幅減小，空化強度減弱。這與張昆明等[23]采用渦流空化制備殼聚糖微球的研究結果相一致。因此，選取適宜的殼聚糖濃度為3.0 g/L。

圖4 入口壓力對微球包封率的影響Figure 4 Effect of inlet pressure on entrapment efficiency

圖5 空化時間對微球包封率的影響Figure 5 Effect of cavitation time on entrapment efficiency

圖6 殼聚糖濃度對微球包封率的影響Figure 6 Effect of chitosan concentrations on entrapment efficiency

2.2.4 殼聚糖和TPP的質量比對微球包封率的影響 由圖7 可知，隨著TPP用量的逐漸增大，微球的包封率呈增大趨勢，并當TPP用量增大使二者質量比減小至2.5∶1時，即相應TPP濃度增大為3.0 g/L時，微球的包封率達到最大為62.3%，此時繼續(xù)增大TPP用量，包封率呈迅速降低趨勢。這是由于在殼聚糖分子數量較多時，逐漸增大TPP的用量，在文丘里管空化條件相同的情況下，二者通過物理交聯形成微球的數量也隨之增多，從而增大了對MIT抑菌劑的包埋量；但繼續(xù)增大TPP用量，帶負電荷的磷酸根陰離子在混合液中的數量也隨之增大，與帶正電荷的殼聚糖分子交聯密度增加，促使交聯生成微球的粒徑增大過快，從而在試驗過程中出現了殼聚糖微球顆粒聚集的絮狀沉淀現象，降低了大量微球與MIT抑菌劑的接觸機會，降低了包封率。因此，為制備得到穩(wěn)定且均勻分散的微球膠體液，應控制殼聚糖和TPP的質量比≥ 2.5∶1。這和林新興[26]的研究結果基本一致。本研究中，選取殼聚糖和TPP的質量比為2.5∶1，即TPP濃度為3.0 g/L。

2.2.5 MIT濃度對微球包封率的影響 由圖8可知，在MIT濃度降低時，微球的包封率隨著MIT濃度的增加呈顯著增大的趨勢。這主要是MIT濃度較低時，殼聚糖分子與TPP分子交聯成微球的過程中，與MIT接觸的幾率較低；當MIT濃度增大時，溶液中MIT的量也會增大，微球在生成過

圖7 殼聚糖與TPP質量比對微球包封率的影響Figure 7 Effect of mass ratio of chitosan and TPP on entrapment efficiency

圖8 MIT濃度對微球包封率的影響Figure 8 Effect of MIT concentrations on entrapment efficiency

程中與其接觸的幾率也隨之增大，故包封率增加。但當MIT濃度增大至0.5 mmol/L時，繼續(xù)增大MIT濃度，包封率呈現降低趨勢。這主要是因為盡管微球對負載MIT的劑量有所增加，但MIT的負載量不及抑菌劑MIT的增加量，所以包封率下降。在MIT濃度為0.5 mmol/L時，微球的包封率達到最大為62.3%。因此，選擇適宜的MIT濃度為0.5 mmol/L。

3 結論

本試驗探討了文丘里管空化對基于離子交聯法的殼聚糖微球制備及抑菌劑包埋的影響，分析了空化入口壓力、空化作用的循環(huán)時間、殼聚糖溶液濃度、殼聚糖和TPP的質量比、抑菌劑MIT濃度等因素對空化制備過程中所得微球包封率的影響，并與傳統機械攪拌下的離子交聯法制備微球進行了比較。結果表明，文丘里管空化制備微球的最佳工藝條件為：空化入口壓力0.2 MPa、空化時間20 min、殼聚糖濃度3.0 g/L、TPP濃度3.0 g/L、MIT濃度0.5 mmol/L，此條件下微球對MIT的包封率可達62.3%；空化入口壓力和殼聚糖濃度的變化均會改變空化場中流體的流動狀態(tài)，影響空化核的生長與空化的強度，進而影響微球包封率；為得到穩(wěn)定且均勻分散的殼聚糖微球膠體液，應控制殼聚糖和TPP的質量比(≥2.5)；與傳統機械攪拌法相比，文丘里管空化制備的微球對抑菌劑MIT的包封率高了17.7%以上。

本研究結果表明，基于文丘里管的水力空化可強化離子交聯法制備殼聚糖微球，并有助于提高對抑菌劑MIT的包埋效果，后續(xù)可對包埋MIT微球的抑菌效果，以及對微球的粒徑大小與分布、微球形貌、釋藥規(guī)律與機制等進行研究，以更好地為水力空化用于殼聚糖微球的制備提供理論依據。

[1] HARISH PRASHANTH K V, THARANATHAN R N. Chitin/chitosan: modifications and their unlimited application potential: an overview[J]. Trends in Food Science & Technology, 2007, 18(3): 117-131.

[2] BERNKOP-SCHNüRCH A, DüNNHAUPT S. Chitosan-based drug delivery systems[J]. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 2012, 81(3): 463-469.

[3] ALISHAHI A. Antibacterial effect of chitosan nanoparticle loaded with nisin for the prolonged effect[J]. Journal of Food Safety, 2014, 34(2): 111-118.

[4] 張媛媛, 張暉, 王立, 等. 磁性殼聚糖微球固定化米糠內源酶的研究[J]. 食品與機械, 2013, 29(3): 51-54.

[5] AZEVEDO M A, BOURBON A I, VICENTE A A, et al. Alginate/chitosan nanoparticles for encapsulation and controlled release of vitamin B2[J]. International Journal of Biological Macromolecules, 2014, 71: 141-146.

[6] HU Li-ming, SUN Yun, WU Yan. Advances in chitosan-based drug delivery vehicles[J]. Nanoscale, 2013, 5(8): 3 103-3 111.

[7] 高艷, 王瑄, 萬明, 等. 殼聚糖微球的制備及其在藥物載體中的應用[J]. 功能材料, 2015, 46(2): 2 007-2 012.

[8] KIILLL C P, BARUD H D S, SANTAGNELI S H, et al. Synthesis and factorial design applied to a novel chitosan/sodium polyphosphate nanoparticles via ionotropic gelation as an RGD delivery system[J]. Carbohydrate Polymers, 2017, 157: 1 695-1 702.

[9] RAZA Z A, ANWAR F. Fabrication of chitosan nanoparticles and multi-response optimization in their application on cotton fabric by using a Taguchi approach[J]. Nano-Structures & Nano-Objects, 2017, 10: 80-90.

[10] 張越, 師憲憲, 于奕峰. 殼聚糖微球的制備方法研究進展[J]. 河北科技大學學報, 2013, 34(5): 434-439.

[11] CARPENTER J, BADVE M, RAJORIYA S, et al. Hydrodynamic cavitation: an emerging technology for the intensification of various chemical and physical processes in a chemical process industry[J]. Reviews in Chemical Engineering, 2017, 33(5): 1-37.

[12] CRUDO D, BOSCO V, CAVAGLIA G, et al. Process intensification in the food industry: hydrodynamic and acoustic cavitation in fresh milk treatment[J]. Agro Food Industry Hi-Tech, 2014, 25(1): 55-59.

[13] GOGATE P R. Hydrodynamic cavitation for food and water processing[J]. Food and Bioprocess Technology, 2011, 4(6): 996-1 011.

[14] 楊鋒, 劉婷, 黃永春, 等. 氣體對渦流空化降解殼聚糖的影響[J]. 食品與機械, 2015, 31(2): 47-51.

[15] ARROJO S, BENITO Y. A theoretical study of hydrodynamic cavitation[J]. Ultrasonics Sonochemistry, 2008, 15(3): 203-211.

[16] GOGATE P R. Cavitational reactors for process intensification of chemical processing applications: a critical review[J]. Chemical Engineering and Processing: Process Intensification, 2008, 47(4): 515-527.

[17] 黃永春, 高海芳, 吳修超, 等. 水力空化強化糖液亞硫酸法脫色的研究[J]. 食品與機械, 2014, 30(3): 5-7.

[18] 蔡軍, 徐根花, 淮秀蘭, 等. 文丘里管內水力空化強度影響因素研究[J]. 工程熱物理學報, 2011, 32(增刊1): 178-181.

[19] 李志義, 張曉冬, 劉學武, 等. 水力空化及其對化工過程的強化作用[J]. 化學工程, 2004, 32(4): 27-29.

[20] BALASUNDARAM B, HARRISON S T L. Study of physical and biological factors involved in the disruption ofE.coliby hydrodynamic cavitation[J]. Biotechnology Progress, 2006, 22(3): 907-913.

[21] 李虹霞, 淮秀蘭, 李勛鋒, 等. 水力空化防除垢實驗研究[J]. 工程熱物理學報, 2010, 31(9): 1 531-1 534.

[22] 劉寶彪, 張昆明, 黃永春, 等. 渦流空化強化載藥殼聚糖微球制備效果初探[J]. 廣西科技大學學報, 2017, 28(3): 52-60.

[23] 張昆明, 劉寶彪, 黃永春, 等. 水力空化強化殼聚糖抗菌微球制備工藝的研究[J]. 保鮮與加工, 2017, 17(2): 12-18.

[24] AGNIHOTRI S A, MALLIKARJUNA N N, AMINABHAVI T M. Recent advances on chitosan-based micro and nanoparticles in drug delivery[J]. Journal of Controlled Release, 2004, 100(1): 5-28.

[25] SINHA V R, SINGLA A K, WADHAWAN S, et al. Chitosan microspheres as a potential carrier for drugs[J]. International Journal of Pharmaceutics, 2004, 274(1/2): 1-33.

[26] 林新興. 載藥殼聚糖微球的制備及其在抗菌紙中的應用[D]. 福州: 福建農林大學, 2014: 12-18.