染色體核型改變在不同類型白血病診斷與治療及預(yù)后判斷中的臨床意義

高 娟

(重慶市九龍坡區(qū)中醫(yī)院檢驗(yàn)科 400016)

白血病為體內(nèi)造血干細(xì)胞發(fā)生突變造成的克隆性惡性腫瘤，是臨床較為常見的腫瘤之一。當(dāng)前對于白血病病因尚不完全清楚，但已經(jīng)證實(shí)白血病從細(xì)胞的起源、分化到生物學(xué)行為的不同而導(dǎo)致白血病的特異性非常高[1-2]。為了準(zhǔn)確、客觀地反映這種生物學(xué)特性，白血病的診斷分型由最初單純以形態(tài)學(xué)為主的分型(FAB分型)發(fā)展為形態(tài)學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)和分子生物學(xué)聯(lián)合起來進(jìn)行的MICM分型。以前對白血病的診斷一般是依據(jù)患者臨床特征和骨髓組織檢測、骨髓細(xì)胞形態(tài)學(xué)和血液學(xué)，患者誤診率比較高，對患者疾病進(jìn)展與預(yù)后提供的參考價(jià)值非常有限。目前隨著分子生物學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)等新技術(shù)的發(fā)展，人們發(fā)現(xiàn)白血病發(fā)生和體內(nèi)染色體異常有直接關(guān)系，對患者染色體進(jìn)行分析能夠顯示其惡性克隆印記，細(xì)胞遺傳學(xué)比細(xì)胞免疫學(xué)與形態(tài)學(xué)表型更精準(zhǔn)地對白血病亞型與分類進(jìn)行區(qū)分，特異性染色體異常對患者選擇不同治療措施也非常重要。從第一個(gè)和白血病有關(guān)的Ph染色體被發(fā)現(xiàn)以來，患者血液惡性腫瘤診療中已廣泛使用細(xì)胞遺傳學(xué)進(jìn)行檢測[3]。本文通過R顯帶技術(shù)對白血病染色體核型進(jìn)行分析，探討其對不同類型白血病診斷與治療及預(yù)后判斷的臨床意義。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2011年2月至2016年2月在本院接受治療的白血病患者367例，其中慢性粒細(xì)胞白血病患者(CML)共137例，男78例，女59例，平均年齡(50.3±8.4)歲，其中加速期(AP)患者6例，慢性期(CP)患者117例，急變期患者(BP)14例；急性白血病(AL)患者230例，男109例，女121例，平均年齡(43.6±7.9)歲，其中急性髓細(xì)胞白血病(AML)患者119例，包含M1～M7分別為11、42、39、10、13、2、2例，急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)患者111例，包含L1～L3分別為29、54、28例。患者診療均依據(jù)《血液病診斷及療效準(zhǔn)則》[4]。

1.2儀器與試劑 設(shè)備：-20 ℃冰箱(日本三洋公司)、光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、臺式自動平衡離心機(jī)(北京醫(yī)用離心機(jī)工廠)、白瓷顯帶缸(蘇州高頻電瓷廠)、電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療廠)。配置試劑：RPMI1640培養(yǎng)液、0.3%肝素、白細(xì)胞稀釋液、秋水仙胺溶液、Earle′s溶液和吉姆薩染液。

1.3方法

1.3.1收集標(biāo)本 本研究收集標(biāo)本為患者骨髓，其抽取數(shù)量依據(jù)患者外周血白細(xì)胞數(shù)量高低來確定，通常是2～4 mL。當(dāng)患者體內(nèi)白細(xì)胞總數(shù)量>9×109/mL，幼細(xì)胞、原細(xì)胞百分比大于11%，可使用外周的血液來培養(yǎng)[5]。

1.3.2制備染色體[6]本文使用短期培養(yǎng)法來進(jìn)行：使用無菌注射器收集外周血2～4 mL或者骨髓液放入肝素抗凝試管中而后放入1640培養(yǎng)瓶內(nèi)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)24 h。而后進(jìn)行阻留中期分裂、收獲細(xì)胞進(jìn)行低滲、固定3次，最后把第3次固定標(biāo)本以1 000 r/min進(jìn)行10 min離心，棄掉上清液，加入適當(dāng)?shù)墓潭ㄒ褐谱鞒杉?xì)胞的懸液，在4 ℃的冰箱內(nèi)進(jìn)行保存。

1.3.3染色體R顯帶[7](1)進(jìn)行制片：使用吸管把細(xì)胞懸液處理均勻以后，從15 cm高處滴至經(jīng)過25%乙醇或者冰水浸泡過的無脂載玻片內(nèi)，一個(gè)載玻片上滴兩滴，在酒精燈火焰上經(jīng)過幾次，使其變得干燥；(2)使用50 mL白瓷立式染缸加入pH為6.6的Earle′s溶液，蓋上蓋子在水浴箱內(nèi)加熱到88 ℃；(3)把制作好載玻片放入上述染缸內(nèi)2 h；(4)取出載玻片晾干以后加入11% Giemsa溶液進(jìn)行15 min染色，清水沖洗，載玻片干燥后在顯微鏡下進(jìn)行觀察。

1.3.4分析染色體的核型 使用顯微鏡對患者染色體核型進(jìn)行分析，每例患者分析15個(gè)中期分裂細(xì)胞，察看染色體是否出現(xiàn)異常。使用顯微相機(jī)對染色體核型進(jìn)行拍照，依次排列成核型。根據(jù)《人類細(xì)胞遺傳學(xué)國際命名體制》對核型進(jìn)行描述[8]。

1.3.5患者的治療效果準(zhǔn)則 完全緩解：患者體征與臨床癥狀消失，骨髓內(nèi)早幼及原粒含量低于5%，血小板計(jì)數(shù)>105×109/L，外周血液內(nèi)中性粒細(xì)胞絕對值>1.6×109/L；部分緩解(PR)：完全緩解中有一項(xiàng)沒有達(dá)到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)；未緩解(NP)：完全緩解中所有項(xiàng)目都沒有達(dá)到相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)。CML完全遺傳學(xué)緩解(CCyR)：患者骨髓內(nèi)沒有Ph陽性細(xì)胞；部分遺傳學(xué)的緩解(MCR)：骨髓內(nèi)Ph陽性細(xì)胞含量在35%以下。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行比較，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1367例患者染色體的核型特征 367例患者中染色體核型異常有302例(82.3%)，核型正常有65例(17.7%)，見表1。

表1 患者染色體的核型情況對比[n(%)]

2.2AL患者染色體核型特征 AL患者中染色體核型特征，見表2。其中數(shù)目異常是非整倍體和多倍體表征，比如-Y、+4、+8、+21和-7等(圖1)。結(jié)構(gòu)異常主要是特異性染色體重新排列而且和FAB亞型有聯(lián)系，比如t(q23;q23)(9;20)、t(q23;q23)(9;20)等。少部分的患者檢查發(fā)現(xiàn)t(q33;q10)(8;21)、t(p13;p12)(7;15)、t(q22;p14)(2;18)等，見圖2。

表2 AL患者核型特征情況對比(n=175)

圖1 ALL患者的染色體核型 46，X，-Y

圖2 ALL患者骨髓細(xì)胞的R顯帶核型45，XY，t(q12;q19)(10;18)

2.3CML患者染色體的核型特征 137例CML患者異常核型情況，見表3。114例Ph陽性表現(xiàn)是典型易位t(q32;q9)(10;19)，見圖3；剩余表現(xiàn)為變異易位比如t(q11;q32;q9)(3;8;19)、t(p23;q9)(2;21)等，見圖4。

表3 CML患者異常的核型情況對比

圖3 CML患者染色體核型異常

圖4 CML患者骨髓細(xì)胞的R顯帶核型

2.4CML患者的染色體的核型變化特征 114例Ph陽性患者內(nèi)檢測出24例有額外染色體出現(xiàn)，慢性期患者中有8例，加速期患者中有5例，急變期患者中有11例，多見與+21、+9和2Ph等，CML患者病程發(fā)展與出現(xiàn)的額外染色體有緊密聯(lián)系，見表4。

表4 CML患者的染色體的核型變化特征情況對比

注：與慢性期對比，#P<0.05

2.5患者治療效果和染色的體核型變化情況 AML-M3有t(15;17)患者中經(jīng)過全反式維甲酸分化治療后24例(24/29)得到緩解，而M3型患者中不伴隨此異常核型患者緩解1例(1/10)對比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。AML-M2有t(9;19)患者中緩解的有29例(29/34)，而不伴隨此核型異常8例患者均沒有緩解，對比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

當(dāng)前MICM分型能夠更好地對白血病本質(zhì)進(jìn)行反映，結(jié)合FAB分型來確認(rèn)AL亞型，對患者治療和預(yù)后有重要影響。通過細(xì)胞遺傳學(xué)對白血病進(jìn)行研究不僅對患者病情分型、治療和預(yù)后有幫助，還能夠顯示出和疾病相關(guān)的新基因與基因位點(diǎn)，對病情的發(fā)生、進(jìn)展和惡性克隆有更深刻的認(rèn)知[9-11]。特別是通過使用免疫學(xué)、形態(tài)學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)聯(lián)合檢測與靶向的治療給難治或復(fù)發(fā)老年AL患者帶來了新希望。MANOLA[12]總結(jié)了近些年來文獻(xiàn)中所研究的常見急性白血病的染色體異常，認(rèn)為t(8；21)(q22；q22)、t(15；17)(q22；21q)、inv(16)(p13;q22)等預(yù)后良好；正常核型、+8、del(7q)、MLL等顯示中等預(yù)后；而-5/del(5q)、-7、t(9；11)(p22；q23)等染色體異常顯示預(yù)后不良或較差。

本文使用細(xì)胞遺傳學(xué)對230例AL患者進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn)，有175例患者出現(xiàn)了染色體核型異常，檢測出結(jié)構(gòu)異常最多是t(14;16)，在AML-M3中較為常見，還有一部分患者伴隨復(fù)雜異常。AML-M3為異性性非常高的白血病，患者體內(nèi)t(14;16)是否存在對其治療有重要影響，而使用砷劑與維甲酸對有此易位患者治療效果非常顯著。t(7;19)易位多見于AML-M2，患者體內(nèi)檢查到t(7;19)發(fā)生易位時(shí)對化療會很敏感，患者生存時(shí)間和緩解率均非常好，比其他染色體發(fā)生畸變緩解率都要高[13]。在WHO分型內(nèi)，t(7;19)是顯示預(yù)后較好的染色體之一。CML是造血干細(xì)胞異質(zhì)性較高的一種疾病，CML患者體內(nèi)比較特征標(biāo)志物是Ph的染色體，同時(shí)也是依據(jù)Ph染色體來對CML進(jìn)行診斷。依據(jù)Ph染色體不僅能夠?qū)撬柙錾C合征、CML和類白血病的反應(yīng)進(jìn)行區(qū)分，還能夠把CML分為Ph陰性與Ph陽性不同類型[14-15]。本研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)Ph陽性患者表現(xiàn)是典型易位，剩余很少一部分患者是變異異位，包含復(fù)雜變異異位與簡單變異異位，而分析生物學(xué)調(diào)查也表示復(fù)雜變異異位內(nèi)有相同分子病理學(xué)變化，它們在患者預(yù)后、臨床和血液學(xué)等方面表現(xiàn)基本一樣。伴隨著患者病情發(fā)展，急變期和加速期患者體內(nèi)會發(fā)生染色體核型變化，表現(xiàn)為出現(xiàn)了Ph染色體以后其他克隆性染色體發(fā)生異常，還會合并有額外染色體出現(xiàn)，這些變化與患者病情發(fā)展聯(lián)系緊密。

綜上所述，AL患者體內(nèi)染色體畸變率比較高，還和FAB分型相關(guān)；CML患者體內(nèi)出現(xiàn)額外染色體和其病情發(fā)展有密切聯(lián)系。

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