4種活化部分凝血活酶時間試劑因子敏感性的量化評估及臨床應用探討

王 威，何曉璇，仝曉寧，劉 哲，鄧 凱，王 剛

(西安交通大學第一附屬醫(yī)院檢驗科，西安 710061)

活化部分凝血活酶時間(APTT)可以反映內(nèi)源性凝血途徑和(或)共同途徑的因子缺乏，并且在多因子缺乏或者明顯的單因子缺乏時表現(xiàn)為時間延長，但當因子缺乏時，APTT是否延長及延長的程度取決于APTT試劑對內(nèi)源性凝血因子的敏感性。不同的APTT試劑對內(nèi)源性凝血因子的敏感性不同，這種差異不僅來源于APTT試劑所采用的激活劑以及磷脂種類的不同，還來源于試劑各組分的濃度差異[1-2]。那么，實驗室如何評估APTT試劑對內(nèi)源性凝血因子FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的敏感性，如何做到標準化評估操作，臨床如何應用因子敏感性不同的試劑，這些均是實驗室亟待解決的問題。美國臨床和實驗室標準化協(xié)會(CLSI)在H47-A2文件中將APTT試劑敏感性定義為APTT升高到已建立的正常參考區(qū)間上限時的因子水平[3]。在我國，實驗室工作人員已注意到不同品牌的APTT試劑對同一份標本的檢測結(jié)果不盡相同，但很少深究造成差異的原因，以及這種差異可能導致的臨床后果[4-5]。國內(nèi)前期研究中，雖然評估了不同APTT試劑的因子敏感性，但并未給出詳細的定量的內(nèi)源性因子敏感性結(jié)果[1]。本研究采用CLSI提供的APTT試劑敏感性的評估方法，量化評估本實驗室可獲得的4種不同APTT試劑的因子敏感性，分析其不同的臨床適用范圍，以及H47-A2未提及的FⅫ對APTT結(jié)果的影響，期望篩選出適用于術(shù)前篩查及單因子缺乏患者篩查的試劑。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 儀器：日本Sysmex CS5100全自動血凝儀；法國恩塔高(STAGO)-R全自動血凝儀。試劑A：APTT測定試劑盒(CS-5100適用)，上海太陽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，接觸激活物為鞣花酸；試劑B：APTT測定試劑盒(STAGO適用)，上海太陽生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)，接觸激活物為白陶土；試劑C：APTT測定試劑盒(Siemens Dade Actin)，西門子(Siemens)生產(chǎn)，接觸激活物為鞣花酸；試劑D：APTT測定試劑盒(STAO?-PTTA)，STAGO公司生產(chǎn)，接觸激活物為硅土。4種APTT試劑組分中所含的磷脂種類均為兔腦磷脂。所有APTT試劑的說明書均注明適用于相關(guān)儀器。CaCl2來自于相應的APTT試劑廠家，濃度均為0.025 mmol/L。

1.2標本來源 凍干標準血漿、凍干乏Ⅷ因子血漿、凍干乏Ⅸ因子血漿、凍干乏Ⅺ因子血、凍干乏Ⅻ血漿均來自于SIEMENS。整個研究過程中，均使用同一批號的凍干血漿。健康人血漿標本來自20～48歲的30例男性和30例女性捐獻者(問卷調(diào)查排除飲食、藥物、疾病等影響因素)，平均年齡28.6歲。標本采用0.109 mmol/L枸櫞酸鈉抗凝，2 000×g離心15 min收獲血漿，無溶血、脂血、黃疸。

1.3方法 凍干標準血漿及乏因子血漿恢復至室溫后，每支加入1 mL蒸餾水復融。標準血漿及單因子缺乏血漿的FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ因子活性，采用Siemens Dade Actin試劑和相應Siemens乏因子血漿試劑在CS-5100儀器進行檢測。APTT因子敏感性評估參照CLSI H47-A2相關(guān)指南進行[3]：用商品化的單因子缺乏血漿與標準血漿按比例配制出不同單因子活性的混合血漿，因子活性范圍為<1%～100%，由此可以得到單因子活性為100%、90%、80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、<1%的11份標本。每份標本一式3份均用4種不同的APTT試劑，在相應的儀器上進行檢測，測定結(jié)果取平均值，且每管間差異(CV%)須小于5%。60例健康捐獻者的標本分離的新鮮血漿分別用4種不同APTT試劑進行檢測，所得APTT檢測結(jié)果用于計算各APTT試劑的正常參考區(qū)間[2]。APTT試劑敏感性為達到正常參考區(qū)間上限的最大因子濃度。正常參考區(qū)間上限定義為APTT測定結(jié)果的均值加2s[2,6]。所有標本均在4 h內(nèi)完成測定。

1.4統(tǒng)計學處理 APTT試劑測定不同因子水平的混合血漿，所得的APTT均值分別與相應的凝血單因子活性擬合非線性回歸曲線，曲線與正常參考區(qū)間上限交叉點的百分活度(%)即相應因子的敏感性[3]。所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學處理采用GraphPad Prism 4(GraphPad Software,Inc.La Jolla,CA,USA)軟件。

2 結(jié) 果

2.1標準血漿與乏因子血漿內(nèi)源性因子活性結(jié)果 標準血漿與乏因子血漿的FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ因子活性，見表1。標準血漿的因子活性均在正常參考范圍內(nèi)。乏因子血漿除去特定的因子活性<1%外，其余因子活性均在正常參考范圍內(nèi)，但低于標準血漿的因子活性。

2.24種不同APTT試劑的內(nèi)源性因子敏感性 4種不同APTT試劑的正常參考范圍上限：試劑A為37.0 s；試劑B為41.1 s；試劑C為40.1 s；試劑D為44.2 s。相應因子的敏感性為非線性回歸曲線與正常參考區(qū)間上限交叉點的百分活度(%)。4種APTT試劑的FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ敏感性，見表2。4種APTT試劑FⅧ敏感性范圍為25.6%(試劑B)～54.0%(試劑A)；FⅨ敏感性范圍為16.5%(試劑B)～37.3%(試劑A)；FⅪ敏感性范圍為19.1%(試劑D)～56.5%(試劑A)；FⅫ敏感性范圍為18.6%(試劑B)～36.4%(試劑A)。試劑A對FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ均表現(xiàn)為最高敏感性，且對FⅧ、FⅪ表現(xiàn)為超敏感(>50%)。試劑B對FⅧ、FⅨ、FⅫ均表現(xiàn)為最低敏感性，且對FⅨ、FⅫ敏感性均低于20%。試劑D對FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ均表現(xiàn)為低敏感性(<30%)，對FⅨ敏感性低于20%，但對FⅧ、FⅨ、FⅫ的敏感性高于試劑Ⅱ。試劑C對FⅧ、FⅨ、FⅪ表現(xiàn)為適中的敏感性(>30%～<50%)，對FⅫ表現(xiàn)為低敏感性(<30%)。

表2 4種不同APTT試劑的內(nèi)源性途徑因子敏感性(%)

3 討 論

本研究應用CLSI H47-A2指南實現(xiàn)了對APTT試劑因子敏感性的量化評估，研究表明4種不同的APTT試劑的內(nèi)源性因子敏感性差異較大。因此，臨床應用中應根據(jù)不同的目的選擇相應的APTT試劑。CLSI H47-A2指出：APTT所在檢測系統(tǒng)(試劑/儀器組合)在FⅧ、FⅨ、FⅪ低于0.3 U/mL(30%因子活性)時，應當表現(xiàn)為時間異常延長，理想狀態(tài)下，試劑對因子的敏感性應該在30%～45%[3]。本研究中，試劑A與試劑C對FⅧ、FⅨ、FⅪ的敏感性均≥30%，符合CLSI指南要求。由于這兩種試劑對FⅧ、FⅨ有較高的敏感性，均可用于亞臨床型血友病A、B[7]的篩查，但試劑A優(yōu)于試劑C。在我國，多數(shù)實驗室的FⅧ、FⅨ活性的檢測是在標準曲線的基礎(chǔ)上，根據(jù)APTT的檢測結(jié)果換算得到血漿中凝血因子的活性值[8]。如果應用對FⅧ、FⅨ不敏感的APTT試劑，在檢測FⅧ、FⅨ輕度缺乏的標本時，不會出現(xiàn)APTT的延長，從而導致所獲得的因子活性值在正常范圍內(nèi)，得到一個假陰性結(jié)果。因此，試劑B與試劑D并不適用于輕型或亞臨床型血友病的篩查，但可作為中度或重度單因子缺乏的確證試劑應用于臨床。

遺傳性FⅪ缺陷癥在臨床較為罕見。FⅪ水平高低與出血的嚴重程度不呈正比，無明顯的自發(fā)性出血傾向[9-10]。但在外傷或手術(shù)中，某些缺乏FⅪ的患者，F(xiàn)Ⅺ的水平高于30 IU/dL，也會有明顯的出血，部分患者FⅪ的水平即便達到40 IU/dL，也會出現(xiàn)嚴重的出血及低凝血酶生成[11]。由此可見，術(shù)前篩查需要FⅪ敏感的APTT試劑，用于檢出FⅪ輕度缺乏的患者，預防術(shù)中的出血。筆者認為，用于術(shù)前篩查的APTT試劑，F(xiàn)Ⅺ敏感性應至少達到40%(40 IU/dL)，才能滿足篩查試驗的要求。本研究中試劑A與試劑C符合要求。

根據(jù)CLSI指南，試劑A與試劑C均可作為合格的術(shù)前篩查試劑應用于臨床。但是，筆者認為適用于術(shù)前篩查的APTT試劑，不僅要考慮其對內(nèi)源性因子FⅧ、FⅨ、FⅪ的敏感性，也需要考慮FⅫ的影響。FⅫ屬于接觸激活因子，是體外模擬內(nèi)源性凝血途徑的啟動因子，在APTT試驗中占有重要的地位。FⅫ活性的減低不會引起明顯的出血現(xiàn)象，有研究報道：遺傳性FⅫ缺陷的患者，F(xiàn)Ⅻ:c為2%，F(xiàn)Ⅻ:Ag<1%時也未見明顯出血[12]。所以，術(shù)前篩查應當選擇對FⅫ的敏感性盡可能低的APTT試劑，以避免FⅫ輕度缺乏導致的APTT延長，誤導臨床醫(yī)生給患者進行后續(xù)的確診試驗，延誤患者治療。試劑A的FⅫ敏感性是本研究中最高的，比試劑C高8%。因此，作為術(shù)前篩查的試劑，試劑A并不合適。試劑B與試劑D雖然FⅫ敏感性低(<25%)，但對FⅧ、FⅨ、FⅪ的敏感性也很低(<30%)。因此，這兩種試劑也不適用于術(shù)前凝血項篩查。試劑C對FⅧ、FⅨ、FⅪ、FⅫ的敏感性處于相對適中的范圍，適用于術(shù)前篩查。

不同的APTT試劑對內(nèi)源性凝血因子的敏感性不同，激活劑是其中很重要的影響因素。本研究中的4種APTT試劑，試劑A因子敏感性高于試劑B，試劑D敏感性最低，與文獻報道不一致[10]，此結(jié)果可能與試劑的其他組分濃度有關(guān)。磷脂的種類和濃度亦會影響APTT檢測結(jié)果[6]，在本研究中，4種試劑所用磷脂雖均為兔腦磷脂，但磷脂濃度未知，因此APTT試劑對因子的敏感性不同是否是由于不同磷脂濃度造成的，還需要進一步研究。

對APTT試劑可以用于普通肝素的監(jiān)測、狼瘡抗凝物質(zhì)檢測及內(nèi)源性因子缺乏檢測，本研究僅關(guān)注了其中的一個方面。目前，幾乎所有廠家的APTT試劑說明書均未標注出APTT試劑的適用范圍，以及對因子、肝素、狼瘡抗凝物質(zhì)的敏感性。如何在眾多APTT試劑中選擇合適的試劑，并將APTT檢測的效用最大化，還需要檢驗工作者加強對試劑的了解，根據(jù)不同的臨床需求選擇相應的試劑，并對所選擇的試劑進行評估。

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