特異性透明質(zhì)酸酶的研究進(jìn)展

[摘要]透明質(zhì)酸酶在臨床上被用作藥物擴(kuò)散劑，它通過(guò)降解腫瘤微環(huán)境和皮膚組織中的透明質(zhì)酸，從而提高組織的通透性來(lái)促進(jìn)藥物的擴(kuò)散和吸收，在腫瘤治療和皮下給藥中都有很好的應(yīng)用前景。透明質(zhì)酸酶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中透明質(zhì)酸的降解作用不僅與其對(duì)透明質(zhì)酸的解聚作用效力有關(guān)，還與酶的底物特異性有關(guān)。近年來(lái)，不斷有專一性降解透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸酶被發(fā)現(xiàn)，本文主要對(duì)目前發(fā)現(xiàn)的特異性透明質(zhì)酸酶的研究現(xiàn)狀作一綜述。

[關(guān)鍵詞]透明質(zhì)酸葡糖胺酶;底物特異性;綜述

[中圖分類號(hào)]R345[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)]2096-5532（2018）06-0750-04

透明質(zhì)酸酶是一類能夠降解透明質(zhì)酸的酶的總稱，1929年首次被DURAN-REYNALS發(fā)現(xiàn)時(shí)稱為“擴(kuò)散因子”[1]，它可以使皮下注射的疫苗、毒素等更好地?cái)U(kuò)散。1940年，該酶被MEYER等[2]正式命名為透明質(zhì)酸酶。此后，在多種生物體內(nèi)以及人體的多種組織中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了透明質(zhì)酸酶。該酶在細(xì)菌中普遍存在，革蘭陽(yáng)性菌產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶主要存在于細(xì)胞莢膜中，革蘭陰性菌產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶一般存在于細(xì)胞周質(zhì)中。此外，在真菌以及非脊椎動(dòng)物如水蛭、甲殼類動(dòng)物的體內(nèi)同樣發(fā)現(xiàn)了透明質(zhì)酸酶的存在。近年來(lái)，不斷有專一性降解透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸酶被發(fā)現(xiàn)，由于其良好的生物學(xué)活性受到更多研究者的關(guān)注。本文主要對(duì)目前發(fā)現(xiàn)的特異性透明質(zhì)酸酶的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1透明質(zhì)酸酶

1.1透明質(zhì)酸酶的生物學(xué)活性

透明質(zhì)酸酶的生物學(xué)活性很多，它作為藥物擴(kuò)散劑，在眼科手術(shù)方面有一定的應(yīng)用[3]。透明質(zhì)酸酶作為工具酶能夠快速降解透明質(zhì)酸，可以用來(lái)制備低分子透明質(zhì)酸和透明質(zhì)酸寡糖[4]。透明質(zhì)酸酶與注射液合用可以消除血腫或水腫，通過(guò)對(duì)透明質(zhì)酸的解聚作用，促進(jìn)局部積貯的血液、滲出液或注射液的快速擴(kuò)散和吸收[5-7]。在抗腫瘤藥物的使用方面，局部注射透明質(zhì)酸酶能夠有效防止紫杉醇外滲性損傷的發(fā)生[8]。此外，在整形美容領(lǐng)域，透明質(zhì)酸酶也常被用于面部注射透明質(zhì)酸除皺后不良反應(yīng)的后處理[9]。

1.2透明質(zhì)酸酶的分類

依據(jù)透明質(zhì)酸酶序列同源性之間的關(guān)系，透明質(zhì)酸酶可分為真核生物來(lái)源透明質(zhì)酸酶和原核生物來(lái)源透明質(zhì)酸酶兩個(gè)大類。來(lái)源于動(dòng)物和人（例如睪丸、精子、皮膚、蛇毒和水蛭等）的真核生物透明質(zhì)酸酶屬于水解酶，主要是從動(dòng)物組織中提取的，應(yīng)用最廣泛的是牛睪丸透明質(zhì)酸酶。2005年12月，F(xiàn)DA批準(zhǔn)重組人類透明質(zhì)酸酶注射劑作為其他注射藥物的輔助藥物。商品化的重組人透明質(zhì)酸酶在醫(yī)藥領(lǐng)域有一定應(yīng)用，其氨基酸序列是PH20[10]。PH20除能夠降解透明質(zhì)酸外還能夠微弱地降解硫酸軟骨素-A，但不降解硫酸軟骨素-B和硫酸軟骨素-C，而牛睪丸透明質(zhì)酸酶對(duì)這些底物均有不同程度的降解作用[11]。原核生物來(lái)源（例如溶血鏈球菌、金黃色葡萄球菌和氣單胞菌等）的透明質(zhì)酸酶屬于裂解酶。這些透明質(zhì)酸酶大多數(shù)除了可以降解透明質(zhì)酸外，還能降解其他種類的糖胺聚糖（例如軟骨素和硫酸軟骨素等），可通過(guò)篩選產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的菌株并從其發(fā)酵液或菌體細(xì)胞中分離到。

2特異性透明質(zhì)酸酶

2.1水蛭透明質(zhì)酸酶

水蛭透明質(zhì)酸酶首次被發(fā)現(xiàn)是在1937年，CLAUDE[12]在水蛭提取液中發(fā)現(xiàn)了這種“擴(kuò)散因子”，后來(lái)被證實(shí)為水蛭透明質(zhì)酸酶。分離純化后研究其酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)，水蛭透明質(zhì)酸酶能夠特異性降解透明質(zhì)酸，不降解除了透明質(zhì)酸以外的黏多糖，屬于水解酶，作用于β-1，3糖苷鍵，降解的主產(chǎn)物是飽和透明質(zhì)酸四糖[13]。水蛭透明質(zhì)酸酶的最適反應(yīng)溫度是38 ℃，最適反應(yīng)pH值為5.5，在50 ℃以下穩(wěn)定[14]。2014年，JIN等[15]采用隨機(jī)引物擴(kuò)增的方法從水蛭的全基因組中擴(kuò)增到第一個(gè)水蛭透明質(zhì)酸酶的基因，通過(guò)蛋白質(zhì)工程技術(shù)和高密度發(fā)酵，成功在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)里實(shí)現(xiàn)了水蛭透明質(zhì)酸酶的高產(chǎn)，酶活力達(dá)到8.42×108U/L。2015年，KANG等[16]對(duì)重組水蛭透明質(zhì)酸酶在畢赤酵母中的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，將酶活力從8.42×108U/L提升到1.24×109U/L。

早在1941年，HIRST[17]就證實(shí)水蛭透明質(zhì)酸酶具有很強(qiáng)的抗菌性能。此外，水蛭透明質(zhì)酸酶具有與其他哺乳動(dòng)物透明質(zhì)酸酶類似的活性，能夠促進(jìn)藥物擴(kuò)散，在青光眼等眼科手術(shù)中具有很好的治療效果[18]。2016年，LV等[19]利用高效液相色譜和質(zhì)譜對(duì)水蛭透明質(zhì)酸酶降解透明質(zhì)酸的終產(chǎn)物進(jìn)行分析，清楚地展示了終產(chǎn)物中四糖和六糖的比例，并獲得了大量的透明質(zhì)酸四糖。與其他的一些寡糖（平均分子量4 000）相比，透明質(zhì)酸四糖和六糖在促進(jìn)血管生成方面顯示出高的生物學(xué)活性，這與牛睪丸透明質(zhì)酸酶產(chǎn)生的四糖和六糖的作用效果相似。這種由水蛭透明質(zhì)酸酶降解產(chǎn)生的高純度透明質(zhì)酸四糖和六糖將會(huì)吸引很多科學(xué)家的興趣，并有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。

2.2動(dòng)物毒液透明質(zhì)酸酶

許多動(dòng)物如蛇、蜥蜴、蜜蜂、蜘蛛等的毒液中都發(fā)現(xiàn)了透明質(zhì)酸酶的存在[20]。大部分動(dòng)物毒液透明質(zhì)酸酶不僅能夠降解透明質(zhì)酸，還能以其他糖胺聚糖如軟骨素和硫酸軟骨素等作為底物[21-22]。2004年，GIRISH等[23]在眼鏡蛇毒液中發(fā)現(xiàn)了對(duì)透明質(zhì)酸絕對(duì)特異性降解的動(dòng)物毒液透明質(zhì)酸酶，該酶分子量為70 406，屬于中性活性的酶，其降解主產(chǎn)物是飽和透明質(zhì)酸四糖。該酶切割β-1，4-糖苷鍵，屬于內(nèi)切-β-N-乙酰氨基己糖苷酶。隨后在蜘蛛毒液、蛇毒液等動(dòng)物毒液中均發(fā)現(xiàn)了這種專一性降解透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸酶。2007年，NAGARAJU等[24]從蜘蛛毒液中分離純化到底物專一性動(dòng)物毒液透明質(zhì)酸酶，該酶的分子量為42 260，最適反應(yīng)溫度為37 ℃，最適pH值為5.8，屬于中性活性的酶，在反應(yīng)中存在300 mmol/L NaCl時(shí)活性最高。2012年，WABBY等[25]在最危險(xiǎn)的埃及角蝰毒液中分離到一種新型透明質(zhì)酸酶CcHaseⅡ，該酶分子量為33 000，最適反應(yīng)溫度為37 ℃，最適pH值為5.5，同樣Na+對(duì)酶活性有促進(jìn)作用。

動(dòng)物毒液是酶和蛋白質(zhì)的混合物，透明質(zhì)酸酶是其重要的組成成分，在促進(jìn)毒素?cái)U(kuò)散方面起到至關(guān)重要的作用。蜜蜂毒液、蝎子毒液等中的透明質(zhì)酸酶是使人體產(chǎn)生IgE介導(dǎo)的致命過(guò)敏反應(yīng)的過(guò)敏原[26]。動(dòng)物毒液透明質(zhì)酸酶的結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制研究具有重要臨床意義，能夠?yàn)槎疽后肴梭w產(chǎn)生病理學(xué)反應(yīng)提供治療依據(jù)，同時(shí)可以進(jìn)一步研究有價(jià)值的無(wú)毒透明質(zhì)酸酶抑制劑，將其作為急救藥物對(duì)被釋放毒液動(dòng)物咬傷的人員進(jìn)行緊急救治。

2.3微生物來(lái)源底物專一性透明質(zhì)酸酶

原核生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶又稱為透明質(zhì)酸裂解酶，能產(chǎn)生透明質(zhì)酸裂解酶的微生物種類有很多。微生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶屬于多糖裂解酶第8、16家族。有些噬菌體也能產(chǎn)生透明質(zhì)酸酶，但是其分子量遠(yuǎn)小于細(xì)菌透明質(zhì)酸酶，而且在胞外環(huán)境下測(cè)得的活性很低[27]。這些透明質(zhì)酸酶大多數(shù)不具有底物特異性，還能降解軟骨素和硫酸軟骨素。但是來(lái)源于鏈霉菌的透明質(zhì)酸裂解酶具有很強(qiáng)的底物特異性，能夠?qū)Ｒ恍越到馔该髻|(zhì)酸[11]。某些細(xì)菌的噬菌體也能產(chǎn)生專一性降解透明質(zhì)酸的透明質(zhì)酸酶。目前，微生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶僅在革蘭陽(yáng)性菌（鏈霉菌）和噬菌體中發(fā)現(xiàn)了這種底物特異性透明質(zhì)酸酶。

2.3.1鏈霉菌透明質(zhì)酸裂解酶鏈霉菌透明質(zhì)酸酶在1970年被OHYA等[28]首次發(fā)現(xiàn)，由于其特殊的底物特異性吸引了很多學(xué)者進(jìn)行研究。后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，該酶與已知微生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶在作用機(jī)制和最終降解產(chǎn)物上是不同的，其他種類微生物來(lái)源的透明質(zhì)酸酶降解透明質(zhì)酸的終產(chǎn)物是不飽和二糖，而鏈霉菌透明質(zhì)酸酶降解透明質(zhì)酸的主產(chǎn)物則是不飽和四糖和六糖[29]，不能降解產(chǎn)生二糖。雖然其降解機(jī)制也是通過(guò)β-消除反應(yīng)進(jìn)行，但它不是進(jìn)行性降解，而是采用隨機(jī)內(nèi)切的方式。2015年，PAVAN等[11]從Streptomyces koganeiensis鏈霉菌中獲得了重組的鏈霉菌透明質(zhì)酸酶rHyal_Sk，該酶分子量為21 600。rHyal_Sk是一種高度專一性降解透明質(zhì)酸的原核生物透明質(zhì)酸酶，而且硫酸化的透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素對(duì)其活性沒(méi)有任何抑制作用，體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)均證明rHyal_Sk具有很好的擴(kuò)散作用，是一種新型“擴(kuò)散因子”。

2.3.2噬菌體透明質(zhì)酸酶鏈球菌透明質(zhì)酸酶（如無(wú)乳鏈球菌、中心鏈球菌和停乳鏈球菌透明質(zhì)酸酶等）可以非特異性地降解一種黏多糖，并且通常能夠作用于透明質(zhì)酸和硫酸軟骨素[30]。然而，寄生于鏈球菌的噬菌體產(chǎn)生的透明質(zhì)酸酶卻對(duì)底物具有強(qiáng)烈的專一性，只能降解透明質(zhì)酸，它們利用合成的透明質(zhì)酸酶依附于透明質(zhì)酸豐富的細(xì)菌膜表面。

目前發(fā)現(xiàn)的噬菌體透明質(zhì)酸酶并不多，有報(bào)道的產(chǎn)透明質(zhì)酸酶的噬菌體只有釀膿鏈球菌10403[31]、H4489A[32]和馬疫鏈球菌前噬菌體7047[33]。1997年，BAKER等[30]發(fā)現(xiàn)釀膿鏈球菌噬菌體透明質(zhì)酸酶專一性降解透明質(zhì)酸，對(duì)其他種類糖胺聚糖都沒(méi)有降解作用，屬于裂解酶，但其降解方式不是進(jìn)行性降解，降解的主產(chǎn)物是不飽和四糖和六糖。2006年，MISHRA等[31]闡明了釀膿鏈球菌10403中的噬菌體透明質(zhì)酸酶HylP2底物特異性的影響因素，HylP2 C末端的結(jié)構(gòu)域是催化結(jié)構(gòu)域，而且僅有C端本身也能催化反應(yīng)的進(jìn)行，但是僅有C端的HylP2不僅能夠降解透明質(zhì)酸，還能夠以硫酸軟骨素作為底物，C端結(jié)構(gòu)域和N端之間特殊的相互作用可能是實(shí)現(xiàn)噬菌體透明質(zhì)酸酶最大酶活力和底物特異性所必需的。該研究首次詳細(xì)地說(shuō)明了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與噬菌體透明質(zhì)酸裂解酶功能之間的關(guān)系。

3展望

透明質(zhì)酸酶的生物學(xué)活性很多，重要的應(yīng)用領(lǐng)域之一是在經(jīng)皮給藥中的應(yīng)用。經(jīng)皮給藥安全性高、易操作，可作為靜脈給藥的替代或備選方案。研究證明，透明質(zhì)酸酶對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)中透明質(zhì)酸的降解作用不僅與其對(duì)透明質(zhì)酸的解聚作用效力有關(guān)，還與其空間位阻、催化機(jī)制和酶的底物特異性有關(guān)，因此這些底物特異性透明質(zhì)酸酶可能在經(jīng)皮給藥促進(jìn)藥物擴(kuò)散方面具有更為重要的應(yīng)用，篩選新型底物特異性透明質(zhì)酸酶將會(huì)成為今后研究透明質(zhì)酸酶一個(gè)重要方向。底物特異性透明質(zhì)酸酶的研究將為預(yù)防和治療透明質(zhì)酸酶相關(guān)疾病提供新的途徑和理論依據(jù)。

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