線粒體DNA在腫瘤中的研究進展

[摘要]人類線粒體DNA（mtDNA）是一個近16 kbp的環(huán)狀雙鏈DNA分子，它編碼氧化磷酸化相關(guān)的幾個重要的亞基，其高突變率和拷貝數(shù)的變化可能在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起了重要作用。近年來，人們越來越多地關(guān)注對線粒體基因組潛在作用的研究，部分結(jié)果還顯示出臨床意義，本文就mtDNA在腫瘤中的研究進展進行綜述。

[關(guān)鍵詞]DNA，線粒體;腫瘤;突變;綜述

[中圖分類號]R730;R342.3[文獻標志碼]A[文章編號]2096-5532（2018）06-0729-05

近一個世紀前WARBURG等[1]就提出線粒體、代謝和癌癥之間存在某種關(guān)系，但是對該領(lǐng)域的研究卻是近些年才引起人們的興趣。線粒體是真核細胞中重要而獨特的細胞器，擁有獨立于細胞核基因組之外的遺傳物質(zhì)，即線粒體DNA（mtDNA）。長期以來mtDNA被認為主要或者唯一的作用就是編碼與氧化磷酸化相關(guān)的多種關(guān)鍵蛋白。對腫瘤和健康組織細胞mtDNA的大規(guī)模測序結(jié)果提示，mtDNA參與了惡性轉(zhuǎn)移，雖然這些發(fā)現(xiàn)的病理相關(guān)性仍然有爭議，但許多研究都證實了mtDNA在癌變過程中的變化[2-3]，其突變的類型和數(shù)量能夠影響細胞生物能學的多個方面，而這被認為是癌癥的標志。因此，闡明mtDNA突變與腫瘤之間的關(guān)系， 對腫瘤的診斷和機制研究具有十分重要的意義。本文主要綜述了mtDNA的結(jié)構(gòu)和功能以及mtDNA與腫瘤的相關(guān)性。

1mtDNA

1.1mtDNA的結(jié)構(gòu)

位于線粒體內(nèi)膜的mtDNA是閉合的環(huán)狀雙鏈DNA分子，其內(nèi)側(cè)鏈被稱為輕鏈（L鏈），外側(cè)鏈被稱為重鏈（H鏈）。人mtDNA由一個非編碼區(qū)（又稱D-環(huán)）和一個編碼區(qū)組成。經(jīng)測序可知，D-環(huán)大小為1 124 bp（16024→16569 →1→576），是調(diào)控mtDNA轉(zhuǎn)錄和復制必不可少的區(qū)域，H鏈和L鏈的啟動子以及H鏈的復制起始位點均位于D-環(huán)，而L鏈的復制起始位點則位于編碼區(qū)[4]。編碼區(qū)位于np 577至np 16023，編碼22個tRNA（14個在H鏈，8個在L鏈）、2個rRNA（在H鏈）以及13個（12個在H鏈，1個在L鏈）與電子傳遞和氧化磷酸化相關(guān)的多肽，這些多肽是構(gòu)成呼吸酶復合物所需的組分，包括了復合物Ⅰ中的7種（ND1、ND2、ND3、ND4、ND4L、ND5和ND6）、復合物Ⅲ中的1種（細胞色素b）、復合物Ⅳ中的3種 （COX Ⅰ、COX Ⅱ和COX Ⅲ）和復合物Ⅴ中的2種（ATP酶6和ATP酶8），只有ND6多肽在L鏈中編碼，而其他12種多肽在H鏈中編碼。除了這13種多肽外，構(gòu)成呼吸酶復合物的大約90種多肽在核DNA（nDNA）中編碼，復合物Ⅱ（琥珀酸-輔酶Q氧化還原酶）的所有亞基則是完全由nDNA編碼。雖然線粒體有自己的基因組，但是調(diào)節(jié)mtDNA復制和轉(zhuǎn)錄所需的所有蛋白質(zhì)均為nDNA編碼。

1.2mtDNA的復制

眾所周知，mtDNA復制不與細胞周期同步，并且獨立于nDNA復制而發(fā)生。然而，所有與mtDNA復制相關(guān)的反式作用因子都由nDNA編碼，這表明細胞核在調(diào)控mtDNA拷貝數(shù)方面扮演了重要的角色。由于轉(zhuǎn)錄和復制在線粒體中是偶聯(lián)的，因此轉(zhuǎn)錄相關(guān)的蛋白也參與了復制。核編碼的mtDNA關(guān)鍵復制因子包括線粒體特異性聚合酶γ（POLG）、線粒體DNA單鏈結(jié)合蛋白（mtSSB）、線粒體解旋酶（Twinkle）和線粒體轉(zhuǎn)錄因子A（TFAM）[5]。POLG是動物線粒體中唯一已知DNA聚合酶[6]，是由分子量分別為12萬～14萬的催化核心和3.5萬～5.0萬的亞基組成的異二聚體復合物。亞基參與了RNA引物結(jié)合，并且還結(jié)合dsDNA。過去人們認為，線粒體中的DNA修復和重組是非常有限的，但POLG具有的3′至5′外切酶活性，以及5′脫氧核糖磷酸合酶活性打破了這一觀念。POLG的組分在一定程度上具有進行mtDNA復制和修復所需的所有活性。mtSSB和Twinkle在復制過程中一起發(fā)揮作用導致了螺旋的不穩(wěn)定[7-8]。mtSSB是一種分子量為1.3萬～1.5萬的蛋白，通常組成分子量為5.6萬的四聚體，對DNA具有高親和力。Twinkle由mtSSBP激活以提高POLG的持續(xù)性和保真度。TFAM是核型結(jié)構(gòu)的必要組分，對于轉(zhuǎn)錄和復制起始是必需的[9]。TFAM除了為mtDNA提供結(jié)構(gòu)外，還被認為調(diào)控了在D-環(huán)（線粒體基因組的順式調(diào)節(jié)區(qū)）的蛋白質(zhì)結(jié)合。重要的是，有實驗表明mtDNA量與總TFAM水平呈正比[10]。

1.3mtDNA拷貝數(shù)

在人細胞中，線粒體分布在細胞質(zhì)中以形成線粒體網(wǎng)，在大多數(shù)時間這些線粒體中的大多數(shù)彼此連接。一般來說，每個細胞中含有數(shù)百至幾千不等的線粒體，每個線粒體有2～10個mtDNA拷貝，因此一個細胞的線粒體基質(zhì)中有幾千個拷貝的mtDNA分子。由于mtDNA的轉(zhuǎn)錄和復制是緊密耦合在一起的，因此只有在mtDNA連續(xù)復制的情況下，mtDNA基因的表達才會促使細胞通過氧化磷酸化產(chǎn)生ATP，這對于需要較多能量的細胞（如心臟、肌肉、神經(jīng)和肝臟細胞）是必不可少的，其他細胞（如脾細胞）對氧化磷酸化沒有嚴格要求，故而具有低mtDNA拷貝數(shù)[11]。

線粒體基因組一個重要的特征是其在細胞中的高拷貝數(shù)，這也被認為是多發(fā)性腫瘤的病理表現(xiàn)，由于線粒體在子代細胞中是隨機分裂的，所以在細胞分裂期間可能存在兩種情況：同質(zhì)（相同分子）或者異質(zhì)（不同mtDNA變體共存）。線粒體的這種性質(zhì)是理解mtDNA突變對細胞影響的關(guān)鍵。因此，細胞最終的表型不僅取決于突變和基因影響的程度，還取決于線粒體異質(zhì)型所占的比例，該現(xiàn)象被稱為“閾效應(yīng)”。mtDNA拷貝數(shù)是被嚴格控制的，但可以在不同組織之間有所變化以及根據(jù)環(huán)境條件而變化，以確保氧化磷酸化功能能夠適應(yīng)細胞的需求[12]，這種適應(yīng)機制同樣適用于腫瘤細胞[13-14]。mtDNA拷貝數(shù)的變化和不同類型癌癥的發(fā)生之間存在著某種相關(guān)性，高水平與淋巴瘤的高風險有關(guān)，但對于骨癌則意味著低風險[15]。

1.4mtDNA損傷和突變

與nDNA相比較，mtDNA易于突變，這可能與其獨特的生物學環(huán)境和特性有關(guān)[16]。對于整個mtDNA結(jié)構(gòu)來說，損傷易發(fā)生在D-環(huán)區(qū)域，特別是兩個高變區(qū)（np 16024～16083和np 57～372）。在眾多類型的D-環(huán)損傷中，D310突變是最常見的一種[17-19]。在D-環(huán)np 303～316之間有一段在np 310位點插入胸腺嘧啶的多具胞嘧啶（5′-C303CCCCC-CT310CCCCCC316-3′），一般來說胸腺嘧啶后的胞嘧啶數(shù)目恒定為6，然而胸腺嘧啶之前的胞嘧啶數(shù)目是高度可變的，通常為7（7-C），但是6-C、8-C、9-C也常見報道[20]。mtDNA D-環(huán)在np 303～309之間的胞嘧啶數(shù)目變化被稱為D310多態(tài)性或D310序列變異性。

2mtDNA與腫瘤的相關(guān)性

2.1腫瘤中的mtDNA突變

mtDNA的突變，例如缺失、點突變和拷貝數(shù)異常等都與許多類型的癌癥密切相關(guān)。有研究人員對mtDNA的D-環(huán)突變進行了定量評價，包括D310區(qū)域在內(nèi)的D-環(huán)突變在頭頸癌[21]、肺癌[22]、乳癌[23]等惡性腫瘤中都有報道。對72對TESCC 的分析揭示了mtDNA D310從食管肌到食管黏膜的同質(zhì)性到異質(zhì)性分布，以及mtDNA D310從食管非腫瘤黏膜到TESCC、再到轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)的異質(zhì)性至同質(zhì)性再分布，并且此變化伴隨有mtDNA拷貝數(shù)的增加[24]。因此，D310突變對線粒體在腫瘤組織生物能功能方面的影響值得進一步研究。

REZNIK等[25]對癌癥基因組圖譜（TCGA）聯(lián)盟的數(shù)據(jù)進行分析，結(jié)果顯示，與鄰近的正常組織相比，許多腫瘤中的mtDNA拷貝數(shù)發(fā)生了改變，且腫瘤類型不同mtDNA拷貝數(shù)的變化也不同;mtDNA水平在腎癌（透明細胞和乳頭狀突起亞型）、乳癌、膀胱癌、肝癌、頭頸鱗狀細胞癌、食管癌中是下降的，而在胸腺癌中是升高的。此外，有研究者在泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤病人[26]、睪丸生殖細胞癌病人[27]和接受放射性治療后的肺癌病人[28]中觀察到循環(huán)mtDNA拷貝數(shù)升高。有研究顯示，在乳腺腫瘤組織中mtDNA含量顯著下降，而在甲狀腺腫瘤組織中mtDNA含量則是增加的[29]。無論mtDNA的拷貝數(shù)是增加還是減少，這些來自不同癌癥的結(jié)果都提示線粒體功能發(fā)生了改變。

2.2mtDNA參與癌變

腫瘤通常具有多個mtDNA變體[30]，這些變體隨機分布且水平各異。有數(shù)據(jù)表明，體細胞mtDNA突變的影響和腫瘤的發(fā)生或程度取決于突變的功能和閾值效應(yīng)[31-33]。越來越多的證據(jù)表明，mtDNA變化可能參與了細胞的癌變，并且最終導致組織的侵襲和轉(zhuǎn)移[34-36]。例如，LIN等[37]對29例新輔助化療后非小細胞肺癌樣本的研究結(jié)果顯示，癌組織中mtDNA拷貝數(shù)與mtDNA的氧化損傷程度顯著相關(guān)，而mtDNA的低拷貝數(shù)和低程度的mtDNA氧化損傷與化療后的肺癌進展有關(guān)。

不僅如此，mtDNA在誘導腫瘤發(fā)生中也發(fā)揮了重要作用。例如，在GBM模型中，mtDNA耗盡和mtDNA非耗盡的細胞分別被移植到免疫缺陷小鼠中，腫瘤會以不同的速率形成：與源自mtDNA未耗盡細胞的腫瘤相比較，源自耗盡50% mtDNA細胞的腫瘤以加速的速率生長;源自耗盡20% mtDNA細胞的腫瘤發(fā)展緩慢，但與mtDNA非耗盡型腫瘤相比，其在晚期發(fā)展得更快;然而與mtDNA非耗盡型腫瘤相比，源自mtDNA耗至3.0%和0.2%細胞的腫瘤卻表現(xiàn)出了發(fā)展遲緩[38]。有研究者將mtDNA缺失的小鼠乳癌細胞移植到免疫受損的小鼠中誘發(fā)腫瘤，結(jié)果從小鼠腫瘤周圍基質(zhì)中檢測到了mtDNA，這再次證明了mtDNA在腫瘤發(fā)生中的重要性[30]。

為了闡明腫瘤發(fā)生與mtDNA變化之間的關(guān)系，LEE等[39]使用3種腫瘤發(fā)生模型（多形性成膠質(zhì)細胞瘤、多發(fā)性骨髓瘤和骨肉瘤）研究表明，mtDNA在早期和晚期腫瘤進展中起決定作用。部分或完全耗盡mtDNA的腫瘤細胞可恢復其mtDNA含量或主動募集mtDNA，從而影響腫瘤發(fā)生率。然而，mtDNA未耗盡的腫瘤細胞在腫瘤早期和晚期以mtDNA基因特異性的方式來調(diào)節(jié)mtDNA拷貝數(shù)。在多形性膠質(zhì)細胞瘤和骨肉瘤中，這一過程伴隨著mtDNA變體的丟失和獲得。mtDNA基因型的變化影響了早期和晚期腫瘤的形態(tài)和基因表達模式，這也為腫瘤治療提供了新靶點。

2.3mtDNA與癌癥進程

雖然mtDNA變化的增強似乎是惡性細胞一般的分子標志，但是這些變化是否直接觸發(fā)了一系列級聯(lián)反應(yīng)使其足以產(chǎn)生有利于腫瘤發(fā)生和進展的突變表型，以及它們在其中發(fā)揮的獨特作用仍然不甚明了。相關(guān)研究已證實，mtDNA變化能夠通過增強腫瘤細胞的侵襲性和轉(zhuǎn)移潛力來加速腫瘤轉(zhuǎn)化和癌癥進展。

CUI等[40]的研究結(jié)果顯示，與相應(yīng)的非癌組織相比較，結(jié)直腸癌組織的mtDNA拷貝數(shù)較低，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。TU等[41]對1 751例局部前列腺癌病人的外周血mtDNA進行分析，結(jié)果表明，低mtDNA拷貝數(shù)與前列腺癌的侵襲性相關(guān)，其他相關(guān)研究也證明了這一點[42-43]。ZHANG等[44]研究了膠質(zhì)瘤病人mtDNA拷貝數(shù)變化情況，結(jié)果顯示，與對照組相比，膠質(zhì)瘤病人的mtDNA拷貝數(shù)增加，且這種增加與腫瘤分級、復發(fā)和死亡呈負相關(guān)，尤其是增加的mtDNA拷貝數(shù)與病人更長的存活時間密切相關(guān)。而一項針對頭頸癌mtDNA的研究結(jié)果顯示，頭頸癌病人的mtDNA拷貝數(shù)明顯增高，mtDNA拷貝數(shù)與癌癥進程相關(guān)，且與病人的生存率呈負相關(guān)[45]。

2.4mtDNA作為腫瘤標記物

近年來，通過檢測臨床樣本中的腫瘤特異性遺傳標記來進行腫瘤篩查已取得了飛速發(fā)展。作為早期腫瘤檢測的分子工具，mtDNA與nDNA相比有其獨特的優(yōu)點。mtDNA長度短、結(jié)構(gòu)簡單，這使得其全基因掃描比使用nDNA更加簡便、高效。不僅如此，mtDNA分子較高的豐度能夠顯著地增強其作為生物感應(yīng)器的能力，在辨別罕見惡性細胞甚至單個細胞方面提高了靈敏度和準確性。病人的體液（例如外周血、唾液、尿液和乳液）便于獲得，這就使得檢測不同腫瘤中突變的mtDNA變得容易起來[21]。

GEURTS-GIELE等[46]在多種類型的腫瘤中評估了線粒體D310突變分析在腫瘤克隆性診斷中的價值。其研究顯示，D310單核苷酸重復在幾種類型腫瘤（包括乳腺、頭頸部、肺、結(jié)直腸和皮膚腫瘤）中頻繁發(fā)生突變。在全部樣本中，有26%的病人在至少一種腫瘤組織中檢測到了D310突變;對于這些病人，D310突變可用于確定其多發(fā)性腫瘤之間的克隆關(guān)系。他們的研究還表明，D310是跟蹤癌細胞克隆擴增的良好標志物，D310突變可能在臨床上有助于確定同時性或異時性腫瘤的克隆形成能力。

不僅如此，腫瘤病人血漿和血清中循環(huán)游離細胞（ccf）mtDNA的發(fā)現(xiàn)也激發(fā)了人們對其診斷價值的興趣。事實上，ccf mtDNA已經(jīng)在許多實體瘤中被當作新的有效的診斷和預后標志物。MAHMOUD等[47]研究表明，乳癌組織中的mtDNA水平均顯著高于對照組（良性疾病病人和健康人），并且具有良好的預后參考價值。ELLINGER等[26]報道，泌尿系統(tǒng)惡性腫瘤病人血清中的ccf mtDNA水平顯著增加，且mtDNA完整性與病人的病理分期和腫瘤分級相關(guān)。LI等[48]對116例乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的肝細胞癌（HCC）和232例病程匹配非癌HBV感染對照的血清樣品進行了循環(huán)mtDNA含量檢測，結(jié)果顯示，HCC病例的循環(huán)mtDNA含量明顯低于對照組。與mtDNA含量較高的HBV感染病人相比較，mtDNA含量較低的病人患HCC的風險顯著升高。一項基于大樣本量胃癌的研究結(jié)果顯示，低mtDNA拷貝數(shù)與胃癌的高風險之間存在著某種關(guān)聯(lián)，且可以作為胃癌診斷的早期指標[49]。雖然腫瘤病人血液中ccf mtDNA變化的主要來源尚不完全清楚，但其作為腫瘤生物標志物的潛在用途是顯而易見的。鑒于目前尚無可靠的早期癌癥診斷方案，若經(jīng)過嚴格的驗證，基于mtDNA的生物標志物的發(fā)展可能能夠有效地補充目前的早期檢測體系，從而提高癌癥診斷的靈敏度和特異性，為臨床醫(yī)生制定或優(yōu)化治療方案提供進一步有用的信息。

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