子癇前期孕婦外周血CTGF基因啟動(dòng)子甲基化檢測(cè)

[摘要]目的檢測(cè)子癇前期孕婦外周血中結(jié)締組織生長因子（CTGF）基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，探討其在子癇前期發(fā)生發(fā)展中的作用。方法收集90例子癇前期病人（子癇前期組）和94例正常妊娠孕婦（正常對(duì)照組）的外周血樣本，采用甲基化特異性PCR（MSP）技術(shù)檢測(cè)CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化水平，對(duì)兩組檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析比較。結(jié)果子癇前期組和正常對(duì)照組CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化陽性率分別為32.2%和46.8%，子癇前期組CTGF基因甲基化水平低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.087，P<0.05）。結(jié)論子癇前期孕婦CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)呈異常的低甲基化狀態(tài)，推測(cè)其在子癇前期的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要意義。

[關(guān)鍵詞]先兆子癇;結(jié)締組織生長因子;DNA甲基化;聚合酶鏈反應(yīng)

[中圖分類號(hào)]R714.244;R394.3[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號(hào)] 2096-5532（2018）06-0706-04

METHYLATION OF CTGF PROMOTER IN PERIPHERAL BLOOD DURING PREECLAMPSIAYANG Cuncun， YANG Zongjun， ZHANG Lu， TANG Qian， LIU Shiguo， HOU Lin（Department of Biochemistry and Molecular Biology， Medical College of Qingdao University， Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo measure the methylation level of connective tissue growth factor （CTGF） promoter in peri-pheral blood during preeclampsia （PE）， and to explore its role in the development and progression of PE. MethodsPeripheral blood samples were collected from 90 pregnant women with PE （PE group） and 94 normal pregnant women （control group）. Me-thylation-specific PCR was applied to determine the methylation rates of CTGF promoter in peripheral blood. The methylation rates of CTGF promoter in two groups were analyzed and compared. ResultsThe methylation rate of CTGF promoter was significantly lower in the PE group than in the control group （32.2%vs46.8%，χ2=4.087，Plt;0.05）.ConclusionPregnant women with PE have an abnormally low level of CTGF promoter methylation， which may contribute significantly to the development and progression of preeclampsia.

[KEY WORDS]pre-eclampsia; connective tissue growth factor; DNA methylation; polymerase chain reaction

子癇前期是一種嚴(yán)重的妊娠期特發(fā)性產(chǎn)科并發(fā)癥[1]。引起子癇前期發(fā)生的因素主要包括胎盤淺著床、胎盤血流灌注不足、胎盤缺血低氧、氧化應(yīng)激、免疫失衡等，而遺傳因素能夠影響以上所有病理生理機(jī)制[2]。表觀遺傳學(xué)主要涉及DNA的甲基化、組蛋白共價(jià)修飾、染色質(zhì)重塑、基因印記、非編碼RNA調(diào)控等方面[3]，其中基因甲基化的研究，為子癇前期的診斷和治療提供了一個(gè)新的視角[4-6]。研究表明，異常的全基因組甲基化以及CpG島甲基化與子癇前期中許多重要功能基因表達(dá)異常有關(guān)，推測(cè)其間接參與了子癇前期的發(fā)生[7]。結(jié)締組織生長因子（CTGF）是一種富含半胱氨酸的分泌肽，在人類多種組織器官中廣泛表達(dá)，具有促進(jìn)血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、刺激細(xì)胞遷移及參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑等功能[8-13]。有研究顯示，子癇前期孕婦血漿及胎盤組織中CTGF mRNA的表達(dá)量明顯高于正常妊娠者，且其表達(dá)水平與子癇前期病情程度及臨床表現(xiàn)相關(guān)，推測(cè)CTGF mRNA表達(dá)上調(diào)可能與其基因啟動(dòng)子區(qū)呈異常的甲基化狀態(tài)有關(guān)[14]。本研究采用甲基化特異性PCR（MSP）[15]方法檢測(cè)CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平，旨在探尋與子癇前期發(fā)病相關(guān)的易感基因，探究子癇前期在表觀遺傳方面的發(fā)病機(jī)制，以期為子癇前期的診治提供新的思路?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1對(duì)象與方法

1.1研究對(duì)象

2017年7月—2018年2月，于青島大學(xué)附屬醫(yī)院、聊城市人民醫(yī)院、濱州市人民醫(yī)院、臨沂市人民醫(yī)院產(chǎn)科，收集90例子癇前期病人（子癇前期組）和94例正常妊娠孕婦（正常對(duì)照組）的外周血樣本。子癇前期的診斷標(biāo)準(zhǔn)參見樂杰主編的第6版《婦產(chǎn)科學(xué)》。正常妊娠孕婦納入標(biāo)準(zhǔn)：本次妊娠正常，胎兒發(fā)育正常，未出現(xiàn)任何并發(fā)癥，既往無不良孕產(chǎn)史，無糖尿病、腎臟疾病、免疫性疾病、癌癥等病史。本研究獲青島大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。子癇前期組病人收縮壓及舒張壓顯著高于正常對(duì)照組（t=30.16、26.04，P<0.01），分娩孕周及胎兒出生體質(zhì)量顯著低于正常對(duì)照組（t=12.42、17.70，P<0.01）;兩組孕婦年齡差異無顯著性（P>0.05）。見表1。

1.2研究方法

1.2.1樣本采集于分娩前采集孕母外周血約2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝管中混勻，-80 ℃冰箱凍存，以備DNA的提取。

1.2.2DNA提取從-80 ℃冰箱中取出收集的樣本，取400 μL孕婦外周血，使用血液基因組DNA提取試劑盒（TIANamp，Beijing，China），根據(jù)試劑盒操作手冊(cè)進(jìn)行DNA的提取，然后置-20 ℃冰箱保存。

1.2.3重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化MSP的模板是經(jīng)重亞硫酸鹽處理的DNA。利用DNA重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化試劑盒（TIANamp，Beijing，China）對(duì)上述提取的DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化修飾，使未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的不變。然后?duì)轉(zhuǎn)化后的產(chǎn)物進(jìn)行純化。

1.2.4MSP由Invitrogen生物公司設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物：一對(duì)結(jié)合處理后的甲基化DNA，另一對(duì)結(jié)合處理后的未甲基化DNA。引物序列見表2。按照MSP試劑盒（TIANamp，Beijing，China）配制20 μL反應(yīng)體系：DNA模板500 ng，上下游引物各1 μL，Taq酶0.4 μL，dNTP 1.6 μL，Buffer 2 μL，用蒸餾水補(bǔ)足20 μL。反應(yīng)條件：95 "℃預(yù)變性5 min;95 "℃變性30 s，52 "℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸20 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃中止5 min。

1.2.5瓊脂糖凝膠電泳取10 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，置于15 g/L瓊脂糖凝膠中電泳，用goldview染色，DNA Marker定位，在紫外線燈下觀察是否擴(kuò)增出目的條帶。若用甲基化特異性引物（M）擴(kuò)增出片段，則說明被檢測(cè)序列存在甲基化（MM）;若用非甲基化特異性引物（U）擴(kuò)增出片段，則說明被檢測(cè)序列不存在甲基化（UU）;若用兩套引物同時(shí)擴(kuò)增出條帶，則說明該檢測(cè)序列呈部分甲基化狀態(tài)（UM）。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所得計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)組間比較采用χ2檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

子癇前期組和正常妊娠組孕婦CTGF基因部分甲基化陽性率分別為10.0%和8.5%，兩組差異無顯著性（P>0.05）;子癇前期組和正常妊娠組孕婦CTGF基因甲基化陽性率分別為22.2%和38.3%，兩組間差異有顯著性（χ2=5.517，P<0.05）。子癇前期組和正常妊娠組孕婦CTGF基因總甲基化陽性率分別為32.2%和46.8%，子癇前期組甲基化水平低于正常對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=4.087，P<0.05）。見圖1、表3。

3討論

子癇前期是一種嚴(yán)重的妊娠期特發(fā)性產(chǎn)科并發(fā)癥，可導(dǎo)致母體多系統(tǒng)不可逆損傷以及胎兒生長受限，是造成孕產(chǎn)婦和圍生兒發(fā)病率及死亡率增加的主要原因之一[1]。文獻(xiàn)報(bào)道，目前國外子癇前期的發(fā)病率為7%～10%[16-17]，而我國約為9.4%[18]，其死亡率占發(fā)病率的15%左右[19]。子癇前期是我國孕產(chǎn)婦死亡的第二大原因。臨床上，子癇前期既可表現(xiàn)為母體綜合征，又可表現(xiàn)為胎兒綜合征[20]。子癇前期期待治療效果甚微，目前唯一治療手段是終止妊娠。因此，尋找能夠診斷和治療子癇前期的有效手段是臨床上亟待解決的問題。

目前，子癇前期的發(fā)病機(jī)制學(xué)說眾多[2]，尚無定論，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為遺傳因素是子癇前期發(fā)生的根本原因，其中與子癇前期發(fā)病相關(guān)的易感基因及表觀遺傳因素在該病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[21]。DNA甲基化是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶的催化作用下，將S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基團(tuán)共價(jià)結(jié)合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位上的過程，最終導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄抑制及表型改變[6]。有文獻(xiàn)報(bào)道，異常的全基因組甲基化以及CpG島甲基化與許多子癇前期重要功能基因表達(dá)異常有關(guān)，推測(cè)甲基化修飾參與調(diào)控了子癇前期的發(fā)生[7]。

CTGF是一種富含半胱氨酸的分泌肽，由349個(gè)氨基酸組成，分子量為34 000～38 000，是CCN家族的成員之一[8]。CTGF最早是作為促進(jìn)纖維化的重要蛋白而被認(rèn)識(shí)的[22]，其作為轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）的下游信號(hào)分子，參與調(diào)節(jié)與纖維化相關(guān)的生物學(xué)過程。近幾年研究發(fā)現(xiàn)，CTGF蛋白還是一種有效的血管生成誘導(dǎo)劑[23]，具有促進(jìn)血管生成、誘導(dǎo)細(xì)胞增殖、介導(dǎo)細(xì)胞黏附、刺激細(xì)胞遷移的功能，還可通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑的表達(dá)參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑[13，24]。MSP是一種用于檢測(cè)基因甲基化的經(jīng)典方法，其原理為：首先用重亞硫酸氫鹽處理基因組DNA，經(jīng)處理后所有未發(fā)生甲基化的胞嘧啶都被轉(zhuǎn)化成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶則保持不變，然后設(shè)計(jì)針對(duì)甲基化和非甲基化序列的引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)MSP擴(kuò)增產(chǎn)物，確定被檢測(cè)DNA序列的甲基化狀態(tài)[15]。本研究采用MSP方法，對(duì)90例子癇前期病人及94例正常妊娠者外周血中CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果顯示，子癇前期組和正常妊娠組孕婦CTGF基因總甲基化陽性率分別為32.2%和46.8%，子癇前期組甲基化水平低于正常對(duì)照組，差異有顯著意義。提示子癇前期病人CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)呈異常的低甲基化狀態(tài)。CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)低甲基化可致該基因表達(dá)上調(diào)，使胎盤組織及母血中CTGF的表達(dá)量增多，導(dǎo)致胎盤損傷進(jìn)而引發(fā)子癇前期。本文結(jié)果表明，子癇前期的發(fā)生與CTGF基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化狀態(tài)有關(guān)，這初步揭示了子癇前期在表觀遺傳方面的發(fā)病機(jī)制，為預(yù)測(cè)子癇前期和實(shí)現(xiàn)子癇前期的早期篩查提供了新思路。

目前關(guān)于CTGF與子癇前期發(fā)病關(guān)系的文獻(xiàn)報(bào)道還比較少，CTGF和TGF-β1在子癇前期發(fā)病中的相互作用機(jī)制還不清楚。今后我們將進(jìn)一步開展體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，探討CTGF在胎盤絨毛外滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲、重塑及血管新生方面的作用機(jī)制，以期為臨床診斷和治療子癇前期提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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