厚樸酚與和厚樸酚對藥物代謝酶CYP2C19活性影響

[摘要]目的了解厚樸的主要成分厚樸酚與和厚樸酚對人體最主要的藥物代謝酶CYP2C19活性的抑制作用，以預測中藥-藥物相互作用可能性。方法采用肝微粒體孵育法，以奧美拉唑為CYP2C19的活性探針藥物，采用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定代謝產(chǎn)物5-羥基奧美拉唑的濃度，計算代謝產(chǎn)物的初始生成速率，比較加入不同濃度的厚樸酚、和厚樸酚或空白溶劑（pH值7.4磷酸鹽緩沖液）時代謝產(chǎn)物的初始生成速率。結果厚樸酚與和厚樸酚對CYP2C19抑制作用的IC50值分別為0.527 μmol/L和0.841 μmol/L，抑制常數(shù)（Ki）分別為0.449 μmol/L和0.702 μmol/L，厚樸酚與和厚樸酚對CYP2C19抑制作用類型均為非競爭性抑制。結論厚樸中厚樸酚與和厚樸酚均對CYP2C19活性有明顯的抑制作用，可能導致藥物相互作用。

[關鍵詞]厚樸酚;和厚樸酚;細胞色素P-450 CYP2C19;草藥-藥物相互作用

[中圖分類號]R969.1;R969.2[文獻標志碼]A[文章編號] 2096-5532（2018）06-0699-04

EFFECT OF MAGNOLOL AND HONOKIOL ON THE ACTIVITY OF THE DRUG-METABOLIZING ENZYME CYP2C19 ""ZHANG Tingting， MA Min， LIU Tao， CAO Zhihong， L"Zhiqiang， XU Wen （Department of Pharmacy， Qingdao Univer-sity Medical College， "Qingdao 266021， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of magnolol and honokiol， the main constituents of Magnolia officinalis， on the catalytic activities of the most important drug-metabolizing enzyme CYP2C19 in human body， and to predict the possibility of traditional Chinese medicine-drug interaction. MethodsThe method of liver microsomal incubation was used， and with omeprazole as the substrate of CYP2C19， liquid chromatography-mass spectrometry was used to measure the concentration of the metabolite 5′-hydroxyomeprazole. The formation velocities of 5′-hydroxyomeprazole were calculated after the addition of va-rious concentrations of magnolol or honokiol or the blank solvent phosphate buffered saline （pH 7.4）.ResultsMagnolol and honokiol showed noncompetitive inhibitory effects on CYP2C19 with IC50 values of 0.527 μmol/L and 0.841 μmol/L， respectively， and the Ki values were 0.449 μmol/L and 0.702 μmol/L， respectively. ConclusionBoth magnolol and honokiol in Magnolia officinalis have a marked inhibitory effect on CYP2C19 and may induce drug-drug interaction.

[KEY WORDS]magnolol; honokiol; Cytochrome P-450 CYP2C19; herb-drug interactions

厚樸是臨床常用的一味中藥，可以燥濕消痰、下氣除滿，主要用于濕滯傷中、脘痞吐瀉、食積氣滯、腹脹便秘、痰飲喘咳等治療[1]。其主要活性成分為厚樸酚與和厚樸酚[2-3]。以厚樸為主要成分的藥方，如藿香正氣液、大承氣湯等經(jīng)常與質(zhì)子泵抑制劑、抗菌藥物等聯(lián)合使用[4-6]，因此了解厚樸與其他藥物的相互作用很有必要。中草藥對細胞色素P450酶及藥物轉運體的誘導和抑制是介導中草藥-藥物相互作用和產(chǎn)生藥物臨床毒副反應的主要機制[7]，而厚樸的相關研究比較少。張培玉等[8]研究顯示，厚樸酚與和厚樸酚對藥物代謝酶CYP2C9有一定的抑制作用。亦有人體外研究發(fā)現(xiàn)，和厚樸酚與厚樸酚均對CYP1A2和CYP2D有抑制作用[9]。厚樸提取物對大鼠CYP2D6亞型也有抑制作用[10]。以上結果表明厚樸對多種代謝酶有抑制作用，易導致藥物相互作用，但是目前研究所涉及的代謝酶種類不全。為了更全面了解厚樸與其他藥物發(fā)生相互作用的可能性，本課題組前期研究了厚樸提取物對5個藥物代謝酶CYP3A4、CYP2D6、CYP2C19、CYP2C9以及CYP1A2活性的影響（這5個酶參與了臨床約75%的藥物的代謝[11]），發(fā)現(xiàn)該提取物對藥物代謝酶CYP2C19和CYP2C9有明顯的抑制作用，尤其對CYP2C19的抑制作用最強[12]。本文在前期研究基礎上，進一步觀察了厚樸中兩種主要活性成分厚樸酚與和厚樸酚對CYP2C19的抑制作用。

1材料和方法

1.1材料與儀器

1.1.1實驗材料厚樸酚與和厚樸酚對照品購于上海一林生物科技有限公司，純度均gt;98%;奧美拉唑、5-羥基奧美拉唑、氯雷他定、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸等，均購于美國Sigma公司;替硝唑購于中國藥品生物制品檢定研究院;氧化型輔酶Ⅱ（NADP+），購于美國Fluka公司;乙腈、甲醇和甲酸均為色譜純，購于美國Tedia公司;其余試劑均為分析純。

1.1.2實驗儀器API 4000+三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜系統(tǒng)，Analyst 1.6.3質(zhì)譜數(shù)據(jù)處理軟件（美國AB公司）;Agilent 1290Ⅱ高效液相色譜儀（配備G7120泵、G7167B進樣器、G7116B柱溫箱，Agilent公司，美國）;Centrifuge 5418型離心機（德國Eppendorf公司），色譜柱為美國Agilent公司ZORBAX SB-C18 column（3.5 μm，2.1×100 mm）色譜柱。

1.2實驗方法

1.2.1NADPH生成系統(tǒng)的配制將葡萄糖-6-磷酸、氧化型輔酶Ⅱ和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶加入到20.0 mol/L氯化鎂溶液中，濃度分別為40.0 mol/L、4.0 mol/L和3.2 kU/L，-20 ℃冷凍備用，1周內(nèi)用完。

1.2.2肝微粒體孵育實驗采用人肝微粒體孵育實驗，以奧美拉唑作為CYP2C19的活性探針[13-14]。微粒體的制備及評價參照文獻方法[15]。孵育體系中先分別加入肝微粒體、奧美拉唑和不同濃度的厚樸酚、和厚樸酚或空白溶劑（pH值7.4的磷酸鹽緩沖液），置于37 ℃水浴中預孵化振蕩5 min，加入NADPH生成系統(tǒng)啟動反應。反應體系的總體積為200 μL，其中肝微粒體、奧美拉唑、厚樸酚或和厚樸酚、NADP+、氯化鎂、葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸的濃度分別為1 g/L、100 μmol/L、1 μmol/L、1 mmol/L、5 mmol/L、0.8 kU/L和10 mmol/L。置于37 ℃水浴振蕩反應1 h后，加入冰乙腈（含內(nèi)標替硝唑0.5 mg/L）終止反應。渦旋混合1 min，以12 000 r/min離心10 min，取上清液10 μL進入LC-MS-MS系統(tǒng)測定5-羥基奧美拉唑的濃度。以氯雷他定作為CYP2C19的陽性抑制劑[16]，將其加入到上述孵育體系中，替換厚樸酚或和厚樸酚，觀察其對CYP2C19的活性影響。

1.2.3液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定5-羥基奧美拉唑的色譜和質(zhì)譜條件儀器使用Agilent 1290Ⅱ高效液相色譜、API 4000+三重四級桿質(zhì)譜;分離使用ZORBAX SB-C18柱（2.1×100 mm，3.5 μm），流動相為乙腈-水-甲酸（V∶V∶V=35∶65∶0.1），流量為0.3 mL/min，柱溫40 ℃，進樣量為10 μL;選用電噴霧（ESI）離子源、正離子模式，采用多反應監(jiān)測的質(zhì)譜掃描方式（MRM）檢測，測定5-羥基奧美拉唑和內(nèi)標的檢測離子分別為：m/z 362.0→214.0和m/z 248.2→121.1，去簇電壓（DP）分別為65和68 V，碰撞能量（CE）分別為12和15 V。質(zhì)譜參數(shù)：碰撞氣（CAD）6×104 Pa，氣簾氣（CUR）4×105 Pa，霧化氣（Gas1）5.5×105 Pa，輔助氣（Gas2）5.5×105 Pa，噴霧電壓（IS）5 500 V，霧化溫度（TEM）550 ℃。

1.2.4抑制作用強弱和作用類型判斷在孵化體系中分別加入0.10、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50、2.00和3.00 μmol/L的待測藥物，分別測得其抑制率，回歸計算IC50值。藥物對CYP2C19的抑制作用以5-羥基奧美拉唑生成速率的降低來表示，以溶劑對照時5-羥基奧美拉唑的生成速率為100%，加入待測藥物后5-羥基奧美拉唑的生成速率為剩余活性，用加入待測藥物組與空白溶劑組酶活性的比值（剩余活性百分率）表示藥物對酶活性抑制作用的強弱，數(shù)值越低表示抑制作用越強。

抑制作用類型的判斷則選擇不同的探針藥物濃度和待測藥物濃度。本實驗選擇探針藥物的濃度（[S]）為底物米氏常數(shù)（Km）的0.5、1.0、2.0、4.0和8.0倍，待測藥物濃度設定為IC50值的0.5、1.0和2.0倍。繪制Lineweaver-Burk曲線，判斷抑制劑的抑制類型并計算其抑制作用的強弱。繪制1/V0 vs 1/[S]曲線（V0為酶反應的初速率），得到不加抑制劑時的Km和Vmax（米氏方程中的最大反應速率），以及加入不同濃度抑制劑時的Km′和Vmax′，如果Vmax=Vmax′則判斷抑制劑為競爭性抑制，通過方程1計算Ki值;如果Km=Km′，則判斷抑制劑為非競爭性抑制，通過方程2計算Ki值。方程1：Km′=Km×（1+[I]/Ki）;方程2：Vm=Vm′×（1+[I]/Ki）。

2結果

2.1不同濃度的厚樸酚、和厚樸酚以及氯雷他定對CYP2C19的抑制作用

隨著厚樸酚與和厚樸酚濃度的不斷升高，其對CYP2C19的抑制作用增強，其抑制作用的IC50值分別為0.527 μmol/L和0.841 μmol/L，強于陽性抑制劑氯雷他定（IC50值為1.370 μmol/L）。見圖1。

2.2厚樸酚與和厚樸酚對CYP2C19抑制類型

厚樸酚與和厚樸酚對CYP2C19抑制作用的Lineweaver-Burk曲線見圖2、3。由圖2可見，不同濃度厚樸酚的Lineweaver-Burk曲線相交于X軸，表明厚樸酚對CYP2C19的抑制作用為非競爭性抑制，根據(jù)方程2計算Ki值為0.449 μmol/L。由圖3可見，和厚樸酚對CYP2C19的抑制作用也是非競爭性抑制，其Ki值為0.702 μmol/L。

3討論

本文厚樸酚與和厚樸酚對CYP2C19抑制作用的IC50值分別為0.527 μmol/L和0.841μmol/L，按照FDA的標準，均為強抑制劑（lt;1 μmol/L）。已有動物實驗結果表明，雖然厚樸酚與和厚樸酚的生物利用度一般，但是二者在肝臟和胃腸道等藥物代謝酶豐富的組織分布很高[17-18]，這增加了體內(nèi)發(fā)生藥物相互作用的可能性。

業(yè)已證實，CYP2C19是人體內(nèi)主要的藥物代謝酶之一[19]，參與市售約8%的藥物的體內(nèi)代謝，其中包括質(zhì)子泵抑制劑、抗癲癇藥物、抗抑郁藥物、氯吡格雷、伏立康唑等多種常用藥物，這些藥物常和含有厚樸酚與和厚樸酚的藥物聯(lián)合使用，對臨床療效和用藥安全產(chǎn)生影響，應當引起警示。比如治療胃病的藥物奧美拉唑等常與含有厚樸的中藥方劑聯(lián)合使用[20]，發(fā)生藥物相互作用的可能性很大，雖然有可能會提高療效，但因結果難以準確預測應盡量避免同時服用[21]。近年來厚樸的抗抑郁作用也備受關注[22]，半夏厚樸湯合并西酞普蘭對產(chǎn)后抑郁癥病人的療效較單用西酞普蘭好[23]。究其原因，一方面厚樸本身有一定的抗抑郁作用[24-25]，另一方面很多抗抑郁藥物也經(jīng)CYP2C19代謝[26]，代謝性的相互作用也可能是療效更好的一個原因。鎮(zhèn)靜催眠類藥物也是經(jīng)CYP2C19代謝的一類藥物[27]，文獻報道藿香正氣片和藿香正氣水可增強地西泮的鎮(zhèn)靜與催眠作用[28-29]。但是利用這種藥物相互作用是一把雙刃劍，如果利用不好有可能增加不良反應[30]。因此，聯(lián)合使用時也應注意藥物的相互作用。

本研究是體外的微粒體實驗，通過對厚樸中抑制作用的成分和作用機制的研究可以更精準地預測藥物相互作用，但主要是對相互作用的警示，下一步需進行體內(nèi)實驗甚至人體試驗進行進一步驗證，并對體內(nèi)的相互作用進行量化，更精準預防甚至合理利用藥物相互作用。

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