球囊損傷血管內(nèi)膜組織CD36和Prdx-2蛋白表達(dá)

[摘要]目的觀察球囊損傷血管內(nèi)膜的增生情況及其內(nèi)CD36和過氧化物酶基因-2（Prdx-2）蛋白的表達(dá)。方法將32只雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)對照組和球囊損傷手術(shù)組，每組16只。球囊損傷手術(shù)組用球囊損傷大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜。分別于術(shù)后14、28 d取兩組大鼠主動(dòng)脈血管壁，行蘇木精-伊紅染色后測量血管壁內(nèi)膜和中膜厚度，并用免疫組織化學(xué)方法檢測血管內(nèi)膜中CD36和Prdx-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果球囊損傷術(shù)后14、28 d，大鼠血管壁內(nèi)膜及中膜顯著增生。球囊損傷后血管內(nèi)膜中CD36蛋白表達(dá)水平增高，與血管內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)（r=0.662，P<0.01）;Prdx-2蛋白表達(dá)水平降低，與血管內(nèi)膜厚度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.516，P<0.05）。結(jié)論血管內(nèi)皮損傷修復(fù)過程中存在內(nèi)膜增生，CD36蛋白表達(dá)上調(diào)及Prdx-2蛋白表達(dá)下調(diào)可能與血管平滑肌細(xì)胞移行、增生及損傷后再狹窄的發(fā)生有關(guān)。

[關(guān)鍵詞]冠狀動(dòng)脈再狹窄;血管內(nèi)膜;創(chuàng)傷和損傷;抗原，CD36;過氧化物酶;大鼠，Wistar

[中圖分類號]R543.3[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號] 2096-5532（2018）06-0680-04

EXPRESSION OF CD36 AND PRDX-2 PROTEINS IN AORTIC INTIMA AFTER BALLOON INJURY "ZHOU Jingwei， REN Beibei， XU Wanqun， MA Chengtai， LI Yonghong（Department of Emergency， The Affiliated Hospital of Qingdao University， Qingdao 266100， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate intimal hyperplasia after balloon injury and the expression of CD36 and Prdx-2 in aortic intima. MethodsA total of 32 male Wistar rats were randomly divided into sham-operation control group and balloon injury group， with 16 rats in each group. In the balloon injury group， the aortic intima was injured by a balloon. The aortic wall was collected on days 14 and 28 after surgery; hematoxylin and eosin staining was performed to measure intima-media thickness， and immunohistochemistry was used to measure the expression of CD36 and Prdx-2 proteins in the aortic intima. ResultsThere was significant intimal-medial hyperplasia on days 14 and 28 after surgery. After balloon injury， there was an increase in the expression of CD36 protein in the aortic intima， which was positively correlated with intimal thickness （r=0.662，Plt;0.01）， and there was a reduction in the expression of Prdx-2 protein， which was negatively correlated with intimal thickness （r=-0.516，Plt;0.05）. ConclusionIntimal hyperplasia is observed during the repair of vascular endothelial injury. Upregulation of CD36 protein and downregulation of Prdx-2 protein may be associated with the migration and proliferation of vascular smooth muscle cells and res-tenosis after injury.

[KEY WORDS]coronary restenosis; tunica intima; wounds and injuries; antigens， CD36; peroxidase; rats， Wistar

經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈成形術(shù)（PTCA）是目前公認(rèn)的治療冠心病的有效手段，但較高的術(shù)后再狹窄發(fā)生率嚴(yán)重影響了其臨床療效[1]。PTCA術(shù)后再狹窄的原因和機(jī)制復(fù)雜，一般認(rèn)為以血管平滑肌細(xì)胞（VSMC）增殖及遷移為主的新生內(nèi)膜過度增生是再狹窄發(fā)生的主要機(jī)制[2-3]。目前大量分子生物學(xué)水平的研究顯示，氧化型低密度脂蛋白（ox-LDL）與其受體血凝素樣氧化低密度脂蛋白受體結(jié)合，激活氧化應(yīng)激，刺激VSMC的增殖和遷移，可促進(jìn)內(nèi)膜增生，進(jìn)而誘導(dǎo)再狹窄的發(fā)生[4-5]。CD36是ox-LDL的另一種受體，參與脂質(zhì)分子（包括ox-LDL）的攝取及血栓形成[6-7]。過氧化物酶基因-2（Prdx-2）為CD36的下游分子，具有抗氧化及自由基清除作用。CD36和Prdx-2是否參與了PTCA術(shù)后再狹窄的發(fā)生，目前國內(nèi)外未有報(bào)道。本研究擬通過觀察球囊損傷大鼠主動(dòng)脈后血管內(nèi)膜增生過程中CD36和Prdx-2的表達(dá)，從分子水平探討CD36和Prdx-2參與再狹窄發(fā)生的機(jī)制，為PTCA術(shù)后再狹窄的防治提供新的研究思路。

1材料與方法

1.1動(dòng)物分組及模型制備

將32只10周齡雄性Wistar大鼠（購自青島藥檢所，體質(zhì)量280～340 g）隨機(jī)分為假手術(shù)對照組（簡稱對照組）和球囊損傷手術(shù)組（簡稱手術(shù)組），每組16只。所有大鼠術(shù)前禁食12 h，術(shù)前1 d至術(shù)后

6期周經(jīng)緯，等. 球囊損傷血管內(nèi)膜組織CD36和Prdx-2蛋白表達(dá)681

3 d每天給予青霉素10萬單位腹腔注射預(yù)防感染。手術(shù)組大鼠應(yīng)用0.6 mol/L水合氯醛（3 mL/kg）腹腔注射全身麻醉后，于大鼠頸部正中略偏左處剪一長約3 cm的切口，用手術(shù)器械鈍性分離出左頸總動(dòng)脈，將自制2 F球囊導(dǎo)管插入動(dòng)脈切口處，并沿主動(dòng)脈走行方向送至腹主動(dòng)脈下端，球囊內(nèi)注入生理鹽水0.1 mL，反復(fù)抽拉導(dǎo)管3次，使其主動(dòng)脈內(nèi)皮剝脫完全。手術(shù)結(jié)束后，取出球囊導(dǎo)管，結(jié)扎左頸總動(dòng)脈，并依次縫合肌肉、皮膚。對照組大鼠除不插入球囊導(dǎo)管外，其余操作同手術(shù)組。

1.2組織學(xué)檢查

于術(shù)后14、28 d，兩組各處死8只大鼠，取腹主動(dòng)脈段4～5 cm，常規(guī)制備切片，蘇木精-伊紅染色，隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域視野，在光鏡下觀察VSMC移行、增殖及內(nèi)膜增生的情況，并用圖像分析儀測量內(nèi)膜、中膜的厚度。

1.3CD36和Prdx-2蛋白的表達(dá)檢測

采用免疫組化SP法進(jìn)行檢測，按照常規(guī)步驟操作。CD36一抗購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，Prdx-2一抗購自美國abcam抗體公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔、兔抗山羊二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。染色后隨機(jī)選取5個(gè)區(qū)域視野，采用Simple PCI分析系統(tǒng)檢測CD36以及Prdx-2蛋白的平均吸光度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，樣本均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn);相關(guān)性檢驗(yàn)采用Person相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1動(dòng)物模型的存活情況

所有32只大鼠均存活，無大鼠因手術(shù)過程或術(shù)后感染死亡。

2.2組織學(xué)檢查

術(shù)后14 d，手術(shù)組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞已覆蓋大部分損傷面，內(nèi)膜中有大量VSMC增殖，內(nèi)膜增生明顯;中膜內(nèi)VSMC增多，中膜增生。術(shù)后28 d，手術(shù)組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞幾乎覆蓋全部損傷面，增殖的VSMC明顯減少，但細(xì)胞外基質(zhì)成分增加，內(nèi)膜繼續(xù)增生。術(shù)后14及28 d時(shí)，與對照組比較，手術(shù)組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜和中膜明顯增厚，差異有顯著性（t=11.71～28.10，P<0.01）。見表1。

2.3血管內(nèi)膜中CD36和Prdx-2蛋白的表達(dá)

CD36蛋白主要表達(dá)于血管內(nèi)膜的內(nèi)皮細(xì)胞和VSMC中，而Prdx-2蛋白主要表達(dá)于血管內(nèi)膜的VSMC。術(shù)后14、28 d時(shí)，與對照組比較，手術(shù)組大鼠主動(dòng)脈血管內(nèi)膜中CD36蛋白的表達(dá)水平均明顯增高（t=2.236、5.564，P<0.05），而Prdx-2蛋白的表達(dá)水平均明顯下降（t=3.176、7.022，P<0.01）。見表2。

2.4血管內(nèi)膜厚度與CD36、Prdx-2蛋白表達(dá)強(qiáng)度的相關(guān)性

球囊損傷后主動(dòng)脈血管內(nèi)膜厚度與CD36蛋白表達(dá)水平呈正相關(guān)（r=0.662，P<0.01），與Prdx-2蛋白表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r=-0.516，P<0.05）。球囊損傷術(shù)后，隨著CD36蛋白的表達(dá)增加，Prdx-2蛋白表達(dá)逐漸降低，但二者的表達(dá)水平無明顯相關(guān)性（P>0.05）。

3討論

PTCA術(shù)后再狹窄是冠心病介入治療的難點(diǎn)之一，目前其發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明。多項(xiàng)研究顯示，支架術(shù)后再狹窄是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程，主要與血管內(nèi)皮損傷和增生、VSMC的遷移和過度增殖、持續(xù)的炎癥反應(yīng)、冠狀動(dòng)脈內(nèi)血栓形成、細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)和肉芽組織增生、血管壁彈性回縮及重塑等有關(guān)[8]。隨著藥物洗脫支架（DES）和藥物涂層球囊（DCB）技術(shù)的出現(xiàn)，支架術(shù)后再狹窄的發(fā)生率已經(jīng)由20%～40%下降至5%～10%[9]。然而，藥物抵抗等因素使得DES術(shù)后再狹窄率仍較高[10-11]，DCB則因不能克服血管壁彈性回縮力，不能完全避免支架術(shù)后再狹窄的發(fā)生，其臨床療效仍缺乏大樣本數(shù)據(jù)支持。因此，本研究進(jìn)一步探討了支架術(shù)后再狹窄發(fā)生過程中VSMC過度增生的分子機(jī)制，以期尋找新的靶點(diǎn)，指導(dǎo)支架術(shù)后再狹窄的臨床防治。

本實(shí)驗(yàn)通過建立大鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮球囊損傷模型觀察到，球囊損傷術(shù)后14及28 d大鼠主動(dòng)脈存在血管重塑：術(shù)后14 d，內(nèi)皮細(xì)胞已覆蓋大部分損傷創(chuàng)面，內(nèi)膜增生明顯并可見大量增殖的VSMC，中膜內(nèi)彈力層迂曲增生;術(shù)后28 d，內(nèi)膜中VSMC增殖明顯減弱，但由于細(xì)胞外基質(zhì)成分的增加，內(nèi)膜繼續(xù)增生。上述結(jié)果與既往的文獻(xiàn)報(bào)道相符[12-13]，證實(shí)了血管重塑過程中存在VSMC的過度增生。

CD36是一種細(xì)胞膜糖蛋白，屬于B類清道夫受體，對ox-LDL具有高度親和性。CD36廣泛存在于多種類型的細(xì)胞，如單核/巨噬細(xì)胞、血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。CD36也是一種黏附分子，在內(nèi)皮損傷的早期即可啟動(dòng)單核細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞的黏附，單核細(xì)胞黏附于血管內(nèi)膜，向內(nèi)膜下遷移并分化為巨噬細(xì)胞，進(jìn)而吞噬大量ox-LDL形成泡沫細(xì)胞，并促進(jìn)VSMC增生及動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成。CD36基因敲除的巨噬細(xì)胞對ox-LDL的結(jié)合及降解能力顯著減弱，因此細(xì)胞膽固醇脂類的沉積也明顯減少[14]。另有研究顯示，與野生型小鼠相比，CD36基因敲除的小鼠在動(dòng)脈損傷后血栓形成時(shí)間延長，且血管壁內(nèi)活性氧分子（ROS）水平明顯降低。SILVERSTEIN等[15]研究證明，CD36活化可促進(jìn)血栓形成。因此，CD36可能通過促進(jìn)血管壁脂質(zhì)沉積、VSMC增生及血栓形成等參與PTCA術(shù)后再狹窄的發(fā)生。本研究結(jié)果顯示，PTCA術(shù)后大鼠血管壁內(nèi)CD36蛋白表達(dá)水平較對照組明顯增高，且其表達(dá)水平與內(nèi)膜厚度呈正相關(guān)，證實(shí)了CD36蛋白在PTCA術(shù)后再狹窄發(fā)生過程中的作用。

過氧化物酶基因（Prdxs）蛋白是新近發(fā)現(xiàn)的一類過氧化物酶，屬于抗氧化蛋白超家族，廣泛存在于原核生物和真核生物中。哺乳動(dòng)物的Prdxs家族包括6個(gè)成員，即Prdx-1～Prdx-6，其中Prdx-2蛋白具有抗氧化及自由基清除、參與細(xì)胞的增生和分化、信號傳導(dǎo)、增強(qiáng)自然殺傷細(xì)胞活性的能力等功能。在Prdx2-/-的頸動(dòng)脈化學(xué)損傷模型小鼠中，血管壁內(nèi)ROS產(chǎn)生明顯增加，血栓形成時(shí)間縮短。本文研究結(jié)果顯示，球囊損傷后血管壁內(nèi)Prdx-2蛋白表達(dá)下降，其表達(dá)水平與血管內(nèi)膜厚度呈負(fù)相關(guān)，提示Prdx-2蛋白可抑制血管內(nèi)皮修復(fù)過程中的內(nèi)膜過度增生。故推測外源性轉(zhuǎn)入Prdx-2蛋白或提高內(nèi)源性Prdx-2蛋白的表達(dá)水平，可以預(yù)防PTCA術(shù)后再狹窄的發(fā)生，我們后續(xù)的研究也將對這一設(shè)想進(jìn)行驗(yàn)證。

LI等[16]的研究結(jié)果顯示，在CD36基因敲除的小鼠，VSMC內(nèi)Prdx-2表達(dá)上調(diào)，提示CD36蛋白可能作為Prdx-2的上游分子，抑制VSMC內(nèi)Prdx-2的表達(dá)，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)，延長血栓形成時(shí)間。因此我們推測，在球囊損傷后的修復(fù)過程中，CD36作為ox-LDL的高親和力抗體，與ox-LDL結(jié)合后一方面促進(jìn)局部脂質(zhì)沉積、VSMC增殖及血栓形成;另一方面抑制局部Prdx-2蛋白的表達(dá)，促進(jìn)局部血栓形成及VSMC的增殖、遷移。本研究中，雖然在球囊損傷后血管壁內(nèi)CD36蛋白表達(dá)增加的同時(shí)，Prdx-2蛋白表達(dá)降低，但二者的表達(dá)水平無明顯相關(guān)性。推測這可能與下述因素有關(guān)：①研究例數(shù)較少;②除Prdx-2外，CD36蛋白還通過其他下游分子調(diào)節(jié)VSMC的增殖。

綜上所述，PTCA術(shù)后再狹窄目前的機(jī)制尚未完全闡明，尚需更多深入的研究。本研究證實(shí)了在PTCA術(shù)后再狹窄血管內(nèi)膜和中膜增生過程中伴隨著CD36蛋白表達(dá)上調(diào)及Prdx-2蛋白表達(dá)下調(diào)，這可能與PTCA術(shù)后再狹窄發(fā)生機(jī)制相關(guān)，其具體機(jī)制有待于在后續(xù)研究中進(jìn)一步探討。

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