氟尿嘧啶聯合TNF-α對人胃癌細胞SGC-7901的抑制作用

[摘要]目的研究5-氟尿嘧啶（5-Fu）聯合腫瘤壞死因子α（TNF-α）對人胃癌細胞SGC-7901的增殖抑制及凋亡誘導的作用，并探討其機制。方法應用噻唑藍（MTT）比色法檢測單用不同濃度5-Fu、TNF-α及兩者聯合應用對SGC-7901細胞增殖的抑制率;采用Hoechst檢測SGC-7901細胞凋亡情況。結果不同濃度的5-Fu（6.25、12.50、25.00、50.00 mg/L）均可抑制SGC-7901細胞增殖（F=32.41，Plt;0.05）;不同濃度的TNF-α（25.00、50.00、100.00、150.00 mg/L）均可抑制SGC-7901細胞增殖（F=28.92，Plt;0.05）;5-Fu （6.25 mg/L）與TNF-α"（25.00、50.00、100.00、150.00 mg/L）聯合應用對SGC-7901細胞的增殖抑制率較單用TNF-α或5-Fu增加（F=28.05，Plt;0.05）。Hoechst檢測結果顯示，100.00 mg/L TNF-α組、6.25 mg/L 5-Fu組及二者聯合應用組均有細胞凋亡現象（F=124.03、46.23，Plt;0.05），且聯合用藥組細胞凋亡率增高（F=124.03，Plt;0.05）。結論TNF-α可增強5-Fu對人胃癌細胞SGC-7901增殖抑制及凋亡誘導的作用，其機制可能為5-Fu、TNF-α分別激活不同的信號通路，并級聯和放大相關的凋亡信號，協同抑制細胞生長，誘導細胞凋亡。

[關鍵詞]胃腫瘤;氟尿嘧啶;腫瘤壞死因子-α;細胞凋亡

[中圖分類號]R735.2[文獻標志碼]A[文章編號] 2096-5532（2018）06-0635-05

INHIBITORY EFFECT OF FLUOROURACIL COMBINED WITH TNF-α"ON HUMAN GASTRIC CANCER CELL LINE SGC-7901ZHU Zhipeng， XU Bo， ZHANG Lijun， QI Hong（Department of Gastrointestinal Surgery， Weihai Central Hospital， Weihai 264400， China）

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the effect of 5-fluorouracil （5-Fu） combined with tumor necrosis factor-alpha （TNF-α） in the proliferation inhibition and apoptosis induction of human gastric cancer cell line SGC-7901 and its mechanism. MethodsAfter the treatment with different concentrations of 5-Fu， TNF-α， or 5-Fu combined with TNF-α， the growth inhibition of SGC-7901 cells was measured by MTT assay. Hoechst assay was used to assess the SGC-7901 cell apoptosis. Results5-Fu at different concentrations （6.25，12.50，25.00， and 50.00 mg/L） inhibited the proliferation of SGC-7901 cells （F=32.41，Plt;0.05）; TNF-α"at different concentrations （25.00，50.00，100.00， and 150.00 mg/L） also inhibited the proliferation of SGC-7901 cells （F=28.92，Plt;0.05）; 5-Fu （6.25 mg/L） combined with TNF-α"（25.00，50.00，100.00， and 150.00 mg/L） significantly increased the inhibition rate of SGC-7901 proliferation compared with TNF-α"or 5-Fu alone （F=28.05，Plt;0.05）. The results of Hoechst assay showed that apoptosis was observed in the 100.00 mg/L TNF-α"group （F=124.03，Plt;0.05）， the 6.25 mg/L 5-Fu group （F=46.23，Plt;0.05）， and the combination groups， and the apoptosis rate was significantly increased in the combination groups （F=124.03，Plt;0.05）. ConclusionTNF-α"can enhance the effect of 5-Fu in the proliferation inhibition and apoptosis induction of human gastric cancer cell line SGC-7901. The mechanism may be that 5-Fu and TNF-α"activate different signaling pathways， and cascade and amplify the related apoptosis signals to inhibit cell growth and induce cell apoptosis in a synergistic manner.

[KEY WORDS]stomach neoplasms; fluorouracil; tumor necrosis factor-alpha; apoptosis

5-氟尿嘧啶（5-Fu）屬于嘧啶類抗代謝抗腫瘤藥物，是國內外腫瘤臨床輔助化療和新輔助化療的常用藥物之一，能抑制細胞代謝，導致尿嘧啶轉化為胸腺嘧啶的進程受阻，干擾DNA合成，同時還能阻斷mRNA翻譯和蛋白質合成，最終導致腫瘤細胞死亡[1]。5-Fu的應用能提高胃癌術后病人的生存率，但仍存在較多的局部治療失敗和遠處轉移[2-3]。研究表明，癌細胞內低氧環(huán)境導致了耐藥性的存在，降低了5-Fu的療效[4-5]。腫瘤壞死因子α（TNF-α）屬于TNF家族，是常見的腫瘤細胞殺傷因子[6]。已有研究結果表明，TNF-α對胃癌、結直腸癌、乳癌等多種腫瘤細胞有殺傷作用[7]，可激活絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）、NF-κB、JNK等3條信號通路，促使腫瘤細胞凋亡[8-10]。本實驗觀察5-Fu聯合TNF-

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α對人胃癌細胞SGC-7901凋亡的誘導作用，并探討其作用機制，為胃癌病人治療提供依據?，F將結果報告如下。

1材料和方法

1.1實驗材料

人胃癌細胞SGC-7901、噻唑藍（MTT，美國Sigma公司）、二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma公司）、RMIP 1640培養(yǎng)基（美國HyClone公司）、胎牛血清（美國HyClone公司）、Hoechst試劑盒（碧云天生物技術研究所）、分光光度計（美國Biotech公司）、酶標儀（美國Bio-Rad公司產品）。實驗所用5-Fu（上海旭東海普藥業(yè)有限公司）、TNF-α（上海恒遠生物公司）均為同一批號。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將SGC-7901接種于RMIP 1640完全培養(yǎng)基（含體積分數0.10胎牛血清）中，置于培養(yǎng)箱（37 ℃、含體積分數0.05的CO2、飽和濕度）中培養(yǎng)，細胞覆蓋率達到80%～90%時用2.5 g/L胰蛋白酶消化傳代，平均3 d傳代1次，取對數生長期的細胞用于實驗。

1.2.2MTT法檢測SGC-7901增殖抑制率將對數生長期SGC-7901以5×107/L的密度接種于96孔培養(yǎng)板，每孔200 μL，24 h后吸除上清液。5-Fu組：加含5-Fu培養(yǎng)液200 μL，質量濃度分別為6.25、12.50、25.00、50.00 mg/L;TNF-α組：加入含TNF-α的培養(yǎng)液200 μL，質量濃度分別為25.00、50.00、100.00、150.00 mg/L;5-Fu+TNF-α組：預先加入6.25 mg/L的5-Fu作用1 h，然后分別加入25.00、50.00、100.00、150.00 mg/L的TNF-α;并設立只含有培養(yǎng)液的空白對照組和不加藥物的細胞對照組。每組設3個復孔。繼續(xù)培養(yǎng)細胞24 h后每孔加MTT（5 g/L）200 μL，4 h后吸去上清液，每孔加入DMSO 150 μL，低速振蕩15 min，在酶標儀490 nm波長下測定每孔的吸光度（A）值。SGC-7901增殖抑制率=（1-A實驗組/A對照組）×100%。

1.2.3Hoechst檢測SGC-7901凋亡指數（AI）將對數生長期SGC-7901以每孔5×104個的密度接種于24孔培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24 h后，吸除上清液，分為4組加藥處理，每組設6個復孔。對照組：只加培養(yǎng)液不加藥物;5-Fu組：加入含濃度6.25 mg/L的5-Fu培養(yǎng)液;TNF-α組：加入含濃度100.00 mg/L的TNF-α培養(yǎng)液;5-Fu+TNF-α組：先加入含濃度6.25 mg/L的5-Fu培養(yǎng)液作用1 h后，再加入含濃度100.00 mg/L的TNF-α培養(yǎng)液。各組細胞培養(yǎng)24 h后，根據Hoechst試劑盒的使用說明書制作細胞涂片，熒光顯微鏡下觀察。200倍顯微鏡下，隨機計數5個視野1 000個以上的細胞，計算AI。AI=凋亡細胞數/總細胞數×100%。

1.3統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計學處理，計數資料結果以±s形式表示，多組數據間比較采用方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。以Plt;0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2結果

2.15-Fu對SGC-7901抑制率的影響

對照組的細胞增殖抑制率為（1.51±0.80）%;5-Fu濃度6.25 mg/L組則為（10.71±3.63）%，12.50 mg/L組為（20.05±8.27）%，25.00 mg/L組為（22.69±7.03）%，50.00 mg/L組為（26.53±5.13）%。濃度為6.25、12.50、25.00、50.00 mg/L的5-Fu作用于SGC-7901細胞24 h后，SGC-7901的生長均受抑制，且抑制強度隨濃度的增加而增強，呈劑量依賴性，各濃度組與對照組比較、不同濃度組間比較差異均有統(tǒng)計學意義（F=32.41，Plt;0.05）。

2.2TNF-α對SGC-7901抑制率的影響

TNF-α濃度25.00 mg/L組細胞增殖抑制率為（4.39±0.65）%，50.00 mg/L組為（4.51±0.86）%，100.00 mg/L組為（4.63±0.53）%，150.00 mg/L組為（4.75±1.05）%。濃度為25.00、50.00、100.00、150.00 mg/L的TNF-α作用于SGC-7901細胞24 h后，SGC-7901的生長均受抑制，與對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（F=28.92，Plt;0.05），各濃度TNF-α對SGC-7901的增殖抑制率比較差異無統(tǒng)計學意義（Pgt;0.05）。

2.35-Fu與TNF-α聯合應用對SGC-7901抑制率的影響

6.25 mg/L 5-Fu是實驗最理想的抑制濃度，更高濃度的藥物明顯誘導細胞死亡，因此本研究選擇6.25 mg/L的5-Fu與TNF-α聯合應用進行實驗。TNF-α（25.00 mg/L）+5-Fu（6.25 mg/L）組細胞增殖抑制率為（21.31±7.76）%，5-Fu（6.25 mg/L）+TNF-α（50.00 mg/L）組為（25.62±6.83）%，TNF-α（100.00 mg/L）+5-Fu（6.25 mg/L）組為（27.37±8.67）%，TNF-α（150.00 mg/L）+5-Fu（6.25 mg/L）

6期祝志鵬，等. 氟尿嘧啶聯合TNF-α對人胃癌細胞SGC-7901的抑制作用637

組為（29.78±6.97）%。低濃度的5-Fu （6.25 mg/L）聯合25.00、50.00、100.00、150.00 mg/L的TNF-α作用24 h均能抑制細胞增殖，差異有統(tǒng)計學意義（F=28.05，Plt;0.05）。

2.45-Fu、TNF-α及二者聯合作用對SGC-7901凋亡的影響

熒光顯微鏡下觀察，凋亡細胞的細胞核染色增強，熒光更為明亮，呈圓狀、固縮狀或團塊狀結構;非凋亡細胞的細胞核呈圓形，淡藍色，內有較深的藍色顆粒，二者形態(tài)迥然相異（圖1）。6.25 mg/L的5-Fu作用于SGC-7901細胞24 h后凋亡率為（7.51±2.63）%，與對照組（1.71±0.60）%比較，差異有統(tǒng)計學意義（F=46.23，Plt;0.05）。單用濃度100.00 mg/L的TNF-α作用于SGC-7901細胞24 h后其凋亡率為（5.26±0.81）%，與對照組相比，差異有統(tǒng)計學意義（F=124.03，Plt;0.05）;二者聯合應用時，SGC-7901凋亡率為（28.53±2.39）%，與二者單用時比較差異有統(tǒng)計學意義（F=124.03，Plt;0.05）。

3討論

5-Fu于1957年被首次合成[11]，是多種化療方案中的基本藥物，屬于嘧啶類抗代謝抗腫瘤藥，能夠抑制尿嘧啶轉化為胸腺嘧啶，干擾DNA的合成;同時能夠阻斷mRNA的翻譯和蛋白質的合成[1]。胸苷磷酸化酶（TP）能將5-Fu轉化為5-氟脫氧尿苷（5FdUrd），5FdUrd將5，10-亞甲基四氫葉酸與胸腺嘧啶合成酶共價結合為一個聚合體，該聚合體能夠抑制尿嘧啶轉化為胸腺嘧啶，干擾DNA的合成，從而導致細胞死亡;5FdUrd還能在胸腺嘧啶激酶的催化下代謝為氟尿苷單磷酸和氟尿苷三磷酸，二者能插入DNA，產生病態(tài)的DNA結構;mRNA聚合酶能識別氟尿苷三磷酸，使得氟尿苷三磷酸代替尿苷三磷酸加入RNA，合成錯誤的RNA，從而阻斷mRNA的翻譯和蛋白質的合成。5-Fu抑制腫瘤的機制之一是誘導凋亡[12]，其對細胞各個周期均有抑制作用，其中以S期的作用最佳[13]，連續(xù)注射可使5-Fu作用于更多的S期細胞，能更大限度殺死腫瘤細胞[14]。然而，5-Fu應用于腫瘤化療的一個潛在限制是其具有相對多變的藥代動力學[15]、自身毒性、較弱的擴散能力及抗藥性。

TNF-α是常見的腫瘤細胞殺傷因子之一，其抗腫瘤機制是多方面的，主要機制為抑制細胞周期的G2期。TNF-α通過與細胞表面的腫瘤壞死因子受體（TNFR）結合發(fā)揮其誘導細胞凋亡功能。TNFR 有TNFR1和TNFR2兩種，TNF-α與兩種受體結合后，通過細胞內一系列反應，協同激活MAPK、NF-κB、JNK等3條不同的信號通路來實現抗病毒、免疫調節(jié)、細胞毒性及細胞凋亡等功能[10]。NF-κB轉錄因子具有結合特異性DNA序列，可以能通過誘導TRAF、TRAF2、1c-IAP、c-ELIP等凋亡抑制因子的表達，抑制含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）的活化，抑制腫瘤細胞的凋亡，促進腫瘤的生長及轉移[16]。JANI等[17]研究發(fā)現， NF-κB的活性受到抑制時，細胞凋亡率有所升高。TNF-α還能作用于腫瘤血管內皮細胞，導致血管功能紊亂。VAN HORSSEN 等[18]研究發(fā)現，TNF-α高度表達能夠導致腫瘤血管內紅細胞和淋巴細胞外滲，發(fā)生出血性壞死，腫瘤血管通透性增加和破壞，使化療藥物在腫瘤局部的藥物濃度升高，最終提高化療療效，降低毒副作用。LANG等[19]研究發(fā)現，TNF-α可誘導腎小球系膜細胞分泌組織因子（TF），TF是血栓形成的主要誘導劑，腫瘤血管血栓形成導致腫瘤

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缺血或繼發(fā)出血壞死;TNF-α可使腫瘤細胞內初級及次級溶酶體數目增多，導致腫瘤細胞自溶、腫瘤出血性壞死。同時，TNF-α可以選擇性地抑制腫瘤血管上皮細胞，抵抗腫瘤新生血管的生成。

腫瘤的p53基因突變使得傳統(tǒng)的化療在實體腫瘤治療中的效果受限制。此外，化療只是殺死迅速分裂的細胞，沒有特異性。TNF家族成員均可以誘導腫瘤細胞凋亡。然而，TNF-α全身給藥具有嚴重的全身毒性[20]，在人體內半衰期很短，單獨應用治療效果不好。研究發(fā)現，TNF-α與純化雷公藤甲素合用時，可以誘導腫瘤細胞凋亡，增加化療敏感性[21]。王雅茹等[22]報道，重組變構人TNF相關促凋亡配體（rmhTRAIL）聯合三氧化二砷（As2O3）對白血病耐藥細胞株凋亡有協同作用。朱青山[23]研究發(fā)現，草酸鉑（L-OHP）聯合新型重組人腫瘤壞死因子（Nrh-TNF）腹腔內注射治療胃腸道腫瘤所致的癌性腹水效果顯著，不良反應輕微，可明顯改善病人生存質量。任莉等[24]研究發(fā)現，TNF聯合化療藥物治療非小細胞肺癌的近期療效優(yōu)于單純化療，具有增敏及協同作用，且毒副作用輕，病人耐受性好。曹關義等[25]研究發(fā)現， TRAIL聯合5-Fu可抑制結腸癌細胞凋亡，具有協同抗腫瘤作用，提高治療效果。綜上所述，5-Fu聯合TNF-α增加了胃癌細胞對5-Fu的敏感性，可協同阻滯胃癌細胞處于G2、S期，抑制細胞生長，誘導細胞凋亡。

5-Fu聯合TNF-α作用于胃癌細胞的研究目前國內罕見報道。本文以5-Fu作為對照，探討TNF-α對SGC-7901的增殖抑制作用以及5-Fu與TNF-α聯合應用對SGC-7901的增殖抑制作用是否具有協同性。結果顯示，不同濃度（25.00、50.00、100.00、150.00 mg/L）的TNF-α對SGC-7901的增殖抑制均較弱，即使單獨應用較高濃度的TNF-α，其誘導的增殖抑制率和細胞凋亡率也很低;然而，5-Fu與TNF-α聯合應用時，SGC-7901增殖抑制率和凋亡率較兩種藥物單獨應用時均明顯提高，說明二者具有協同作用;5-Fu可明顯抑制SGC-7901的生長，且5-Fu對SGC-7901的抑制作用強于TNF-α;與單用5-Fu或TNF-α相比，聯合給藥組SGC-7901的增殖抑制作用明顯增強，且與TNF-α濃度呈正相關。

總之，TNF-α可增強5-Fu對人胃癌細胞SGC-7901的促凋亡作用，其機制可能為5-Fu、TNF-α分別激活不同的信號通路，并級聯和放大相關的凋亡信號，協同抑制細胞生長，使其停滯于G2、S期，最終誘導細胞凋亡。在臨床應用中，我們可以通過二者的協同作用，減少化療藥物的用量，在保證抗腫瘤效果的同時，減輕化療帶來的不良反應，提高病人的生存期及生活質量。

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