白藜蘆醇抑制人結腸癌細胞增殖與骨形態(tài)發(fā)生蛋白7的關系研究

朱茄慧，曾于樺，王 涵，廖云鵬，馬 妍，吳 柯，何百成

(1.重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室，2.重慶醫(yī)科大學藥理學教研室，重慶 400016)

結腸癌是常見的消化道腫瘤，每年約有120萬新發(fā)病例和60萬死亡病例[1]?，F(xiàn)階段，對結腸癌的治療方式包括手術、放射治療和化療。雖然已引入靶向藥物治療結腸癌，如貝伐單抗、西妥昔單抗、帕尼單抗等，但預后仍不能令人滿意[2]。因此，臨床仍急需研發(fā)能治療結腸癌且高效低毒的藥物。傳統(tǒng)中藥或中藥有效單體衍生物是治療癌癥的有效藥物來源之一，如喜樹堿、長春新堿、紫杉醇等[3]。白藜蘆醇(resveratrol，Res)是天然多酚類化合物，又稱芪三酚。研究表明，Res可以抑制胰腺癌、乳腺癌、結腸癌等多種癌細胞增殖及促凋亡[4]。對于結腸癌，盡管Res的抗癌作用已得到驗證[5]，但該作用的具體分子機制尚不十分清楚。

骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是轉化生長因子TGF-β超家族的一個亞族，在調控胚胎發(fā)育的多個關鍵步驟，以及各種細胞的生長、分化和凋亡調節(jié)中起重要作用。目前，已經(jīng)確定約20個BMP亞族成員[6]。據(jù)報道，BMP可能與癌癥發(fā)生發(fā)展有關，如BMP9可在肝癌細胞中促進增殖和抗凋亡[7]，BMP2在卵巢癌細胞中促進增殖[8]。同時，也有研究表明，BMP信號在腫瘤中也具有相反的作用，如BMP7能抑制胃癌、腎癌、乳腺癌、結腸癌細胞增殖[9]。BMPs不僅可以通過經(jīng)典的BMP/Smad途徑傳遞信號，還可通過非經(jīng)典的BMP/Smad途徑發(fā)揮功能，如PI3K/Akt信號。PI3K/Akt信號已被發(fā)現(xiàn)在多種癌癥中過度激活，而PTEN作為一種抑癌基因，可負性調節(jié)PI3K/Akt信號的轉導活性[10]。本研究主要對Res抑制HCT116細胞增殖作用與BMP7的關系進行分析，并初步探討B(tài)MP7發(fā)揮該作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞株 HCT116細胞系購自American Type Culture Collection(ATCC)，細胞培養(yǎng)條件為5% CO2及37 ℃，培養(yǎng)基為含10% FBS的DMEM(100 kU·L-1青霉素及0.1 g·L-1鏈霉素)。

1.1.2試劑 Res購于西安昊軒生物科技有限公司；本實驗所用一抗均購自Santa Cruz Biotechnology公司；HRP標記二抗購于碧云天生物技術公司；Annexin V-EGFP試劑盒購于南京凱基生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購于上海七海復泰生物科技有限公司；PCR試劑盒購于TaKaRa公司。

1.1.3儀器 細胞培養(yǎng)箱(美國Thermo公司)，倒置熒光顯微鏡(日本Nikon公司)，定量PCR儀及凝膠成像儀(美國Bio-Rad公司)，脫色搖床(上海世平實驗儀器有限公司)，垂直電泳槽和濕式轉膜儀(北京六一儀器廠)。

1.2重組腺病毒載體構建本實驗按照AdEasy系統(tǒng)構建重組腺病毒載體。通過PCR將人源BMP7、綠色熒光蛋白(GFP)及PTEN的編碼序列進行擴增，PTEN的siRNA片段通過商業(yè)合成獲得，然后將這些片段分別克隆到穿梭載體pAdTrace中，并重組。將正確的重組載體線性化，轉染到HEK293細胞中，包裝重組腺病毒。所得重組腺病毒分別命名為AdBMP7、AdPTEN和AdsiPTEN。重組腺病毒分別用GFP和紅色熒光蛋白(RFP)標記，僅表達GFP的重組腺病毒(AdGFP)作為載體對照。

1.3細胞增殖檢測將HCT116細胞接種至96孔板中(密度3×103每孔)，用不同濃度的Res、重組腺病毒或DMSO處理細胞24、48、72 h。檢測時，每孔加入CCK-8 10 μL，并在37℃孵育4 h，用酶標儀在波長450 nm測定吸光度。每組實驗重復3次。

1.4細胞周期及凋亡檢測將HCT116接種在6孔板中，并用Res不同濃度(0、20、40、60 μmol·L-1)處理48 h。對于細胞周期分析，收集細胞并用4℃的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌，用70%、50%、30%乙醇(4℃)固定。用PBS洗滌，加入含RNase(1 g·L-1)的碘化丙啶(PI，20 g·L-1)溶液1 mL，染色細胞30 min，最后用流式細胞儀測定。對于細胞凋亡分析，收集細胞并用PBS(4℃)洗滌后，采用Annexin V-EGFP & PI雙染色法處理細胞，通過流式細胞儀進行分析。每組實驗重復3次。

1.5總RNA提取及PCR實驗將HCT116接種至T25瓶養(yǎng)瓶，貼壁后，用不同濃度的Res或DMSO處理細胞。用TRIzol試劑提取RNA，逆轉錄試劑盒制備cDNA，最后用半定量PCR檢測目的基因的表達。PCR引物序列為：GAPDH，上游引物5′-CAACGAATTTGGCTACAGCA-3′，下游引物5′-AGGGGAGATTCAGTGTGGTG-3′；BMP7，上游引物5′-GGCAGGACTGGATCATCG-3′，下游引物5′-AAGTGGACCAGCGTCTGC-3′。每組實驗重復3次。

1.6Westernblot實驗將HCT116細胞接種至6孔板，用不同濃度Res或與相應的重組腺病毒處理。在設定的時間點，收集細胞裂解液并煮10 min。將所有樣品進行SDS-PAGE電泳，并轉移到PVDF膜上，依次與相應的一抗和辣根過氧化物酶標記的二抗孵育，采用ECL試劑盒顯影成像。每組實驗重復3次。

2 結果

2.1Res對HCT116細胞增殖的影響CCK-8檢測結果顯示，Res能明顯抑制HCT116細胞增殖(Fig 1A)。Western blot結果顯示，Res能增加PCNA的水平(Fig 1B)，且呈濃度依賴性。細胞周期分析結果顯示，Res明顯增加S期細胞比例(Fig 1C)。結果提示，Res對HCT116細胞增殖有抑制作用。

Fig 1 Effects of Res on proliferation of HCT116 cells

A: CCK-8 assay results showed the anti-proliferative effect of Res on HCT116 cells; B: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein level of PCNA in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; C: Flow cytometry analysis results showed the cell cycle arrest effect of Res in HCT116 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

2.2Res對HCT116細胞凋亡的影響Western blot結果顯示，Res在HCT116細胞中，升高Bad水平的同時，降低Bcl-2的水平(Fig 2A)。Annexin V-EGFP染色結果表明，Res能增加細胞凋亡數(shù)量(Fig 2B)。結果提示，Res對HCT116細胞的凋亡具有促進作用。

2.3Res對HCT116細胞中BMP7表達水平的影響Western blot結果顯示，BMP7在常見的結腸癌細胞(HCT116、SW480、LoVo、HT29、CaCO2、SW620)以及FHC細胞中均有表達，但在結腸癌細胞中BMP7的表達要明顯高于FHC細胞(Fig 3A)。PCR和Western blot分析結果顯示，Res能以濃度和時間依賴的方式上調BMP7的mRNA和蛋白水平(Fig 3B、3C)。結果提示，Res抑制HCT116細胞增殖的作用可能與促進BMP7表達有關。

2.4BMP7對Res抑制HCT116細胞增殖作用的影響CCK-8測定結果顯示，過表達BMP7能降低癌細胞的生存活力，且明顯增強Res的抗增殖作用；BMP7抗體能部分逆轉Res對HCT116細胞的抗增殖作用(Fig 4A)。Western blot結果表明，BMP7增加Res上調Bad水平的作用，同時也增強Res降低Bcl-2水平的作用(Fig 4B)。BMP7抗體減弱Res對Bad和Bcl-2蛋白水平的影響(Fig 4C)。結果提示，BMP7參與介導Res對人結腸癌細胞的增殖抑制作用，但具體機制不詳。

Fig 2 Effects of Res on apoptosis-inducing in HCT116 cells

A: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein levels of Bad and Bcl-2 in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; B: Annexin-V EGFP staining results showed the effect of Res on apoptosis in HCT116 cells.

Fig 3 Effects of Res on the expression of BMP7 in HCT116 cells

A: Western blot analysis results showed the endogenous expression of BMP7 in colon cancer cells and FHC cells, GAPDH was used as loading control; B: PCR analysis results showed the effect of Res on the mRNA expression of BMP7 in HCT116 cells; C: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein level of BMP7 in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control.

A: CCK-8 assay results showed the effect of BMP7 or BMP7 specific antibody on the anti-proliferation effect of Res on HCT116 cells.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsRes group; B: Western blot analysis results showed the effect of BMP7 on protein levels of Bad and Bcl-2 affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; C: Western blot assay results showed the effect of BMP7 specific antibody on protein levels of Bad and Bcl-2 affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control.

2.5BMP7通過PI3K/Akt信號影響Res抑制HCT116細胞增殖的作用Western blot分析結果顯示，Res對Smad1/5/8磷酸化水平無明顯影響(Fig 5A)，但能降低Akt1/2和磷酸化Akt1/2/3(p-Akt1/2/3)的水平(Fig 5B)。提示BMP7對Res抗增殖作用的影響可能并非由經(jīng)典BMPs/Smads信號介導，而是與PI3K/Akt信號有關。進一步Western blot檢測結果顯示，過表達BMP7增強Res降低Akt1/2和p-Akt1/2/3水平的作用(Fig 5C)，BMP7抗體明顯減弱Res的這種作用(Fig 5D)。以上結果提示，Res抑制HCT116細胞增殖的作用可能與上調BMP7表達，進而抑制PI3K/Akt信號轉導有關。

2.6BMP7和Res對HCT116細胞中PTEN磷酸化的影響Western blot分析結果顯示，Res對HCT116細胞中PTEN的總蛋白水平無明顯影響，但明顯降低PTEN的磷酸化水平(Fig 6A)。過表達BMP7可增強Res降低PTEN磷酸化水平的作用(Fig 6B)，而BMP7抗體能減弱Res降低PTEN磷酸化水平的作用(Fig 6C)。結果提示，在HCT116細胞中Res可上調BMP7表達，從而抑制PTEN的磷酸化，最終降低PI3K/Akt信號的轉導活性。

3 討論

結腸癌是臨床常見的惡性腫瘤，每年約60萬人因患結腸癌而死亡[1]。盡管結腸癌的治療已取得較大的進展，但預后仍不理想。因此，臨床仍急需低毒而高效的藥物來治療結腸癌。本研究表明，Res能明顯抑制HCT116細胞增殖并促進其凋亡，Res的這種作用可能與上調BMP7表達，進而抑制PTEN的磷酸化，并最終降低PI3K/Akt信號傳導活性有關。

Res主要用作營養(yǎng)補充劑，具有保護心血管、抗血小板聚集、抗氧化、抗炎、降血糖等藥理作用[11]。研究證明，Res可以抑制多種腫瘤細胞增殖，如結腸癌。研究表明， Res的抗癌活性可能與多種信號或因子有關，如抑制TNF-α、p38 MAPK、PI3K/Akt信號等[12]，但具體的分子機制尚不十分清楚。BMPs是屬于TGF-β超家族成員，BMPs對細胞的增殖、分化和凋亡具有調節(jié)作用。因此，BMPs的功能異常與多種腫瘤有關，如BMP2、BMP6、BMP7[8]。BMPs不但能通過BMPs/Smads信號實現(xiàn)對多種生理過程的調節(jié)，還可通過非經(jīng)典BMPs/Smads信號發(fā)揮作用，如PI3K/Akt、MAPK、NF-κB等[13]。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Res可以提高HCT116細胞中BMP7的水平，外源性BMP7能增強Res對HCT116細胞增殖抑制作用，但BMP7抗體明顯減弱Res的這種抗增殖作用。提示BMP7可能參與介導Res對HCT116細胞的抗增殖活性，但機制仍不清楚。

Fig 5 Effects of BMP7 on PI3K/Akt signaling affected by Res in HCT116 cells

A: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein levels of Smad1/5/8 and p-Smad1/5/8, GAPDH was used as loading control; B: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein levels of Akt1/2 and p-Akt1/2/3 in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; C: Western blot analysis results showed the effect of BMP7 on protein levels of Akt1/2 and p-Akt1/2/3 affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; D: Western blot analysis results showed the effect of BMP7 specific antibody on protein levels of Akt1/2 and p-Akt1/2/3 affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control.

Fig 6 Effects of BMP7 on phosphorylation of PTEN affected by Res in HCT116 cells

A: Western blot analysis results showed the effect of Res on protein level of PTEN and p-PTEN in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; B: Western blot analysis results showed the effect of BMP7 on protein level of PTEN and p-PTEN affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control; C: Western blot analysis results showed the effect of BMP7 specific anti-body on protein level of PTEN and p-PTEN affected by Res in HCT116 cells, GAPDH was used as loading control.

由于BMPs可通過經(jīng)典和非經(jīng)典BMPs/Smads信號發(fā)揮調節(jié)作用，因此，本研究對兩種信號轉導活性進行分析。結果發(fā)現(xiàn)，Res對Smad1/5/8的磷酸化無明顯影響，而Res本身能促進BMP7表達。提示BMP7可能通過非經(jīng)典BMPs/Smads信號介導Res的抗結腸癌作用。PI3K/Akt信號對細胞的增殖、存活和分化具有調節(jié)作用，在多種腫瘤中被過度激活，并且也是一種非經(jīng)典的BMP/Smads信號。Res能抑制腫瘤細胞中的PI3K/Akt信號[4]，本研究經(jīng)Western blot分析也證明，Res能抑制Akt磷酸化。因此，我們推測Res對PI3K/Akt信號的抑制作用可能與其促進BMP7表達有關。實驗結果顯示，BMP7過表達可增強Res對PI3K/Akt信號的抑制作用，而BMP7抗體則減弱Res對HCT116細胞中PI3K/Akt信號的影響。提示在HCT116細胞中，BMP7可能通過抑制PI3K/Akt信號傳導來介導Res的抗增殖活性。但BMP7在干細胞中能激活PI3K/Akt信號[14]，導致這種不同的效應可能與細胞種類以及細胞所處微環(huán)境有關。PI3K/Akt信號受到多種因子調節(jié)，如可被IGF激活，但能被PTEN抑制。我們推測，BMP7在HCT116細胞中對PI3K/Akt信號轉導的抑制作用可能與上調PTEN有關。結果顯示，Res對HCT116細胞中PTEN的總蛋白水平無明顯影響，但可以明顯降低PTEN的磷酸化平，與文獻報道相一致[15]。BMP7過表達能增強Res降低PTEN磷酸化水平的作用，而BMP7抗體則明顯減弱Res在HCT116細胞中抑制PTEN磷酸化的作用。

本研究結果表明，Res對人結腸癌細胞增殖具有抑制作用，可能是一種治療結腸癌的有效藥物。Res的這種作用可能與其促進BMP7表達而抑制PTEN磷酸化，最終使PI3K/Akt信號轉導活性降低有關。課題組將進一步確認在其他結腸癌細胞中Res對BMP7表達的影響及相關分子機制，為Res用于臨床預防和治療結腸癌提供依據(jù)。

[致謝：本實驗在重慶市生物化學與分子藥理學重點實驗室完成。 感謝何通川教授(T.C.HE，芝加哥大學醫(yī)學中心)為本實驗饋贈所需的重組腺病毒載體。]

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