枳殼多糖對(duì)輻射損傷小鼠的防護(hù)作用研究

舒尊鵬，楊燕妮，王 毅，王秋紅，匡海學(xué),2

(1.廣東藥科大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)北藥基礎(chǔ)與應(yīng)用研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150040)

隨著臭氧層逐漸稀薄、手機(jī)等電子產(chǎn)品使用頻率增加、放化療病人人數(shù)持續(xù)增長(zhǎng)，以及近年來(lái)的核泄漏事件都提示著輻射已成為一個(gè)威脅人類健康不可忽視的重要因素。輻射可以導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生大量?jī)?nèi)源性自由基，降低免疫力，損傷組織臟器，加速機(jī)體衰竭，嚴(yán)重影響生命質(zhì)量。此外，輻射還可直接導(dǎo)致多種DNA損傷[1]，造成染色體畸變和基因突變，危害久遠(yuǎn)。因而，從傳統(tǒng)天然中草藥中尋找出毒副作用低、不良反應(yīng)少，具有抗輻射作用明顯的有效成分顯得極為重要。

多糖是一類由醛糖或酮糖通過(guò)糖苷鍵連接成的天然大分子多聚物[2]，是中藥中主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)之一。研究表明，多糖具有一定的抗輻射作用，可清除自由基，降低造血系統(tǒng)損傷，是一類很有前景的天然輻射防護(hù)劑。例如黑木耳多糖對(duì)60Co照射的動(dòng)物能夠提高其存活率[3]，王慶賓等[4]發(fā)現(xiàn)香菇多糖、枸杞多糖也同樣具有抗輻射作用。枳殼為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥未成熟果實(shí)，為中醫(yī)臨床常用中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為木部中品。枳殼中所含的化學(xué)成分較復(fù)雜，其中枳殼多糖類成分具有一定的抗氧化和免疫調(diào)節(jié)作用[5]，為新一代安全的抗氧化劑及免疫調(diào)節(jié)劑[6]，同時(shí)也為枳殼多糖抗輻射研究奠定了理論基礎(chǔ)。因此，本實(shí)驗(yàn)將枳殼熱提粗多糖(CitrusaurantiumL.polysaccharides-B，CALB)作為研究對(duì)象，并對(duì)其抗輻射作用進(jìn)行初步研究。

1 材料

1.1藥材枳殼藥材0.8 kg，粗粉碎后加入體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇浸泡過(guò)夜，加熱回流提取3次，每次3 h，體積分?jǐn)?shù)為0.95的乙醇脫脂后，冷水浸提。浸提后的藥渣，用熱水煎煮3次，每次3 h，冷卻后濾過(guò)、合并濾液。濾液減壓濃縮，經(jīng)醇沉、透析、冷凍干燥得CALB。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠(合格證號(hào)SCXK2)，♀♂各半，體質(zhì)量(18±2)g，由北京維通利華生物科技公司提供。

1.3試劑小牛血清(Sigma公司)；Giemsa染液(中國(guó)惠世生化試劑有限公司)；丙二醛(malondialdehyde, MDA)測(cè)定試劑盒、超氧化物岐化酶(superoxide dismutase, SOD)測(cè)定試劑盒、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathion peroxidase, GSH-Px)測(cè)定試劑盒、總乙酰膽堿酯酶(total cholinesterase, TChE)測(cè)定試劑盒，均購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.4儀器765型紫外可見分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)；GAMMA 1-16 LSC plus型真空冷凍干燥機(jī)(Marin Christ公司)；KQ-5200型超聲波破碎儀(北京益植康生物科技有限公司)；SpectraMax plus型酶標(biāo)儀(Molecular Devices公司)；TDL-5型臺(tái)式離心機(jī)(上海科興儀器有限公司)；CX23型顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

2 方法

2.1實(shí)驗(yàn)分組及造模處理取BALB/c小鼠360只，隨機(jī)分為6組，每組60只，分為空白對(duì)照組(Control)、輻射模型組(Model)、CALB高、中、低劑量組(400、200、100 mg·kg-1)、陽(yáng)性對(duì)照黑木耳多糖組(HP 200 mg·kg-1)，按照小鼠體質(zhì)量10 mL·kg-1給予不同體積藥液，空白對(duì)照組和輻射對(duì)照組給予生理鹽水。每天1次，連續(xù)灌胃給藥30 d。末次給藥3 h后，隨機(jī)6組小鼠分為兩批，一批(20只)采用60Co γ-射線一次性全身照射(7 Gy)，于照射后記錄各組d 2(10只)、d 14(10只)小鼠存活率；另一批(40只)60Co γ-射線一次性全身照射(3 Gy)，于照射后d 2(20只)、d 14(20只)分別采取小鼠眼球取血，隨后脫頸處死，取相應(yīng)組織(骨髓、腦、肝、脾和胸腺)，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2實(shí)驗(yàn)檢測(cè)指標(biāo)及方法頸椎脫臼處死小鼠，剝離出股骨，用注射器吸取D-Hank’s溶液，沖出股骨中的全部骨髓細(xì)胞，用分光光度計(jì)在260 nm處測(cè)定小鼠骨髓DNA含量。擠出適量骨髓液與玻片一端的小牛血清混勻，常規(guī)涂片。甲醇固定，放入Giemsa應(yīng)用液中，染色后，立即用磷酸鹽緩沖液沖洗，晾干，測(cè)定小鼠骨髓微核細(xì)胞含量。按說(shuō)明書要求，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定小鼠腦組織中TChE的吸光度值。另按說(shuō)明書要求，測(cè)定血清中、腦中和肝臟中MDA含量，以及SOD和GSH-Px活性。同時(shí)，測(cè)定脾指數(shù)及胸腺指數(shù)。計(jì)算公式為：脾(胸腺/肝)指數(shù)=脾(胸腺/肝)重量/小鼠體質(zhì)量×10。

3 結(jié)果

3.1CALB對(duì)輻射小鼠存活率的影響如Tab 1所示，與輻射組相比，d 2檢測(cè)存活率發(fā)現(xiàn)，各給藥組輻射小鼠的存活率均較高，其中CALB高、中劑量組效果較好，存活率接近于空白對(duì)照組；d 14檢測(cè)存活率發(fā)現(xiàn)，CALB藥效呈劑量依賴性，且高劑量組好于陽(yáng)性對(duì)照藥。

3.2CALB對(duì)輻射小鼠骨髓細(xì)胞DNA含量的影響如Fig 1所示，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠骨髓細(xì)胞的含量明顯下降(P<0.01)，說(shuō)明60Co γ-射線可造成骨髓細(xì)胞的損傷。與模型組相比，CALB中、高劑量組小鼠骨髓DNA含量呈上升趨勢(shì)，差異有顯著性 (P<0.01)，說(shuō)明CALB具有一定保護(hù)骨髓細(xì)胞DNA的作用。

Tab 1 Influence of CALB on survival rate

Fig 1 Comparison of bone marrow cell DNA content in different CALB groups

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

3.3CALB對(duì)輻射小鼠骨髓細(xì)胞微核的影響如Fig 2所示，d 14取材，與空白對(duì)照相比，模型組小鼠骨髓細(xì)胞微核數(shù)明顯增加(P<0.01)，說(shuō)明輻射對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞有明顯的損傷作用，即骨髓細(xì)胞凋亡，染色體溢出。與模型組相比，CALB中、高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)小鼠骨髓細(xì)胞微核數(shù)增高有明顯的抑制作用(P<0.05，P<0.01)。

Fig 2 Effect of CALB on micronucleus

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

3.4CALB對(duì)輻射小鼠腦組織中MDA、SOD、GSH-Px和TChE的影響Tab 2結(jié)果顯示，d 14取材，模型組小鼠與空白對(duì)照組相比，腦組織MDA含量明顯升高(P<0.01)，SOD、GSH-Px和TChE活性均明顯下降(P<0.01)。與模型組相比，CALB高劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組可使小鼠腦組織中MDA含量降低，SOD和GSH-Px活性升高，差異有顯著性 (P<0.01)。CALB各劑量給藥組及陽(yáng)性對(duì)照藥組小鼠腦中的TChE活性均無(wú)明顯變化(P>0.05)。

3.5CALB對(duì)輻射小鼠血清MDA、SOD和GSH-Px的影響Tab 3結(jié)果顯示，在輻射后d 2，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠血清中MDA含量明顯升高，SOD與GSH-Px活性明顯降低(P<0.01)，但是各給藥組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。在輻射后d 14，與模型組相比，CALB中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠血清MDA含量均有明顯降低，SOD與GSH-Px活性明顯升高，差異均有顯著性 (P<0.01)。

3.6CALB對(duì)輻射小鼠肝組織MDA、SOD和GSH-Px的影響Tab 4結(jié)果顯示，在輻射后d 2，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠肝組織中MDA含量明顯升高，GSH-Px與SOD活性明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，CALB各劑量組對(duì)GSH-Px與SOD活性的提高無(wú)明顯影響，但CALB中、高劑量組對(duì)MDA含量有明顯的降低趨勢(shì)(P<0.05，P<0.01)，并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性。在輻射后d 14，與模型組相比，CALB中、高劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝組織中GSH-Px活性明顯升高(P<0.05，P<0.01)。CALB各劑量組及陽(yáng)性對(duì)照組小鼠肝組織中SOD活性明顯升高，MDA含量明顯降低，差異有顯著性 (P<0.01)。

3.7CALB對(duì)輻射小鼠脾、胸腺指數(shù)的影響Tab 5結(jié)果顯示，在輻射后d 2，與空白對(duì)照組相比，模型組小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)明顯降低(P<0.01)。與模型組相比，CALB高劑量組脾指數(shù)有明顯增加的趨勢(shì)(P<0.01)，CALB中、低劑量組無(wú)明顯變化。此外，CALB中、高劑量組胸腺指數(shù)有明顯增加的趨勢(shì)(P<0.01)，而低劑量組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在輻射后d 14，與模型組相比，CALB中、高劑量組小鼠脾指數(shù)、胸腺指數(shù)明顯升高，差異有顯著性 (P<0.01)，陽(yáng)性對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

Tab 2 Effect of CALB on MDA, SOD, GSH-Px and TChE in brain n=18)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

Tab 3 Effect of CALB on MDA, SOD, GSH-Px in blood n=17)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

Tab 4 Effect of CALB on MDA, SOD and GSH-Px in liver n=18)

##P<0.01vscontrol;*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Tab 5 Effect of CALB on spleen index and thymus index n=15)

##P<0.01vscontrol;**P<0.01vsmodel

4 討論

輻射損傷是由電離輻射引起的急性、慢性或遲發(fā)性的機(jī)體損傷，在有氧條件下，電離輻射會(huì)導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)產(chǎn)生大量自由基，而自由基的產(chǎn)生會(huì)引起生物膜磷脂中脂質(zhì)的過(guò)氧化，造成氧化應(yīng)激損傷，進(jìn)而引起細(xì)胞代謝障礙[7]。MDA是生物膜上不飽和脂肪酸受自由基攻擊發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化的產(chǎn)物，其含量可以作為衡量機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過(guò)氧化程度和自由基水平的一項(xiàng)重要指標(biāo)[8]。SOD是清除氧自由基的重要酶系，可阻止氧化自由基鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)大，是生物體內(nèi)氧自由基清除系統(tǒng)的重要防線[9]，其活性的高低間接地反映機(jī)體清除氧自由基的能力[10]。GSH-Px則主要通過(guò)催化GSH變?yōu)镚SSG，使有毒的過(guò)氧化物還原成無(wú)毒的羥基化合物[11]?？寡趸窼OD、GSH-Px活性降低，造成過(guò)量的ROS得不到有效的清除。這些過(guò)量的ROS會(huì)氧化生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的生物大分子，并產(chǎn)生有害的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA[12-13]。因此，增強(qiáng)SOD活性來(lái)清除輻射所引起的自由基，促使MDA含量減少，可對(duì)由輻射造成的機(jī)體損傷起到保護(hù)和修復(fù)作用。

多糖具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用，是固有免疫系統(tǒng)的主要靶分子，也是許多中藥的主要活性成分，具有調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、抗腫瘤、抗病毒、抗氧化等功效。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)檢測(cè)輻射后小鼠的存活率、骨髓細(xì)胞DNA、骨髓細(xì)胞微核含量，小鼠腦組織、血清及肝臟中SOD和GSH-Px活性，MDA含量和腦組織中TChE活性，以及脾、胸腺指數(shù)等，探討了CALB對(duì)60Co γ-射線照射小鼠的保護(hù)作用。骨髓細(xì)胞DNA、骨髓細(xì)胞微核含量可作為診斷輻射損傷的重要依據(jù)。通常情況下，電離輻射直接作用于核酸、蛋白質(zhì)及酶類等分子水平上，引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，DNA損傷或是DNA分子交聯(lián)。因此，微核的檢出率能夠準(zhǔn)確地反映出輻射損傷的程度、DNA受損的情況，以及機(jī)體的修復(fù)能力。研究表明，CALB能明顯提高輻射小鼠的存活率，對(duì)輻射小鼠骨髓DNA具有保護(hù)作用，并且可降低骨髓細(xì)胞微核數(shù)，呈劑量依賴性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還發(fā)現(xiàn)，60Co γ-射線(3 Gy)輻射照射后d 2取材，模型組輻射小鼠與空白組相比，腦組織中MDA、SOD、GSH-Px和TChE不存在明顯差異，因此在本實(shí)驗(yàn)結(jié)果中未展現(xiàn)數(shù)據(jù)。但照射后d 14取材，模型組小鼠較空白對(duì)照組相比，腦組織中MDA、SOD、GSH-Px和TChE均有明顯變化。推測(cè)60Co γ-射線(3 Gy)這種低劑量輻射可能先對(duì)血液、肝臟、胸腺、脾等臟器造成氧化應(yīng)激損傷，隨著時(shí)間的推移，氧化損傷逐步延伸至腦組織。數(shù)據(jù)表明CALB可降低輻射小鼠腦組織、血液及肝臟中MDA的含量，升高SOD和GSH-Px的活性，通過(guò)抑制氧自由基的方式達(dá)到抗輻射作用。但對(duì)TChE未產(chǎn)生變化，其原因可能為輻射小鼠的腦損傷為輻射后逐步形成的，而CALB給藥周期后的延遲效果還不足以扭轉(zhuǎn)TChE在腦組織中的表達(dá)。另外，胸腺與脾臟是重要的免疫器官，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)輻射小鼠脾、胸腺指數(shù)的測(cè)定，進(jìn)一步說(shuō)明CALB還可通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)起到抗輻射損傷的作用。

綜上研究結(jié)果表明，輻射對(duì)小鼠的多項(xiàng)生理指標(biāo)產(chǎn)生了明顯的損傷作用，而各劑量的CALB可通過(guò)抗氧化和免疫調(diào)節(jié)機(jī)制對(duì)輻射損傷產(chǎn)生不同程度的保護(hù)作用。

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