奧曲肽對隱孢子蟲感染后乳鼠空腸生長抑素受體4和5 mRNA表達(dá)的影響

劉 新，朱 銳，白 杰

(新疆醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，新疆 烏魯木齊 830011)

感染后腸易激綜合征(post-infectious irritable bowel syndrome,PI-IBS)可發(fā)生于腸道急性感染后，是腸易激綜合征的常見類型，臨床表現(xiàn)為腹痛、脹氣和排便異常。其病理生理學(xué)機(jī)制尚不清楚，可能與腸道持續(xù)存在低度炎癥、黏膜免疫系統(tǒng)被激活、黏膜神經(jīng)叢和肌神經(jīng)纖維密度增加以及腸道高敏性有關(guān)[1]。

隱孢子蟲(Cryptosporidium.parvum)屬于頂復(fù)合器門隱孢子屬的細(xì)胞外寄生蟲，是引起腹瀉的主要原因之一，人群普遍易感。免疫功能正常的人體或動(dòng)物感染后，產(chǎn)生自限性腹瀉；免疫缺陷性病人如艾滋病，引起的慢性腹瀉是致死的重要原因。該原蟲主要感染腸上皮細(xì)胞，在腸道形成卵囊后，隨糞便排出[2]。本課題組以往在出生5日齡有免疫力的乳鼠上，通過灌胃105隱孢子蟲卵囊, 已成功建立PI-IBS動(dòng)物模型[3]。結(jié)果表明，從感染后d 10～17腹腔注射奧曲肽(50 μg·kg-1·d-1)可降低腸敏感性，減少空腸肥大細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)量，降低神經(jīng)纖維密度[3]，但其機(jī)制不清。

奧曲肽作為生長抑素類似物，是生長抑素受體2(somatostatin receptor 2，SSTR2)和SSTR5激動(dòng)劑。本課題組前期研究表明[4]，SSTR1、SSTR2 mRNA在隱孢子蟲感染后14 d增加，奧曲肽能降低感染后37 d的SSTR2 mRNA水平，但在感染后50 d，奧曲肽使SSTR1、SSTR2、SSTR3 mRNA表達(dá)增加。而SSTR4、SSTR5 mRNA水平在感染過程中是否有變化，及奧曲肽是否能影響SSTR4、SSTR5 mRNA表達(dá)水平尚不清楚。本研究擬觀察隱孢子蟲感染乳鼠后，空腸SSTR4、SSTR5 mRNA表達(dá)的變化，同時(shí)探討奧曲肽對感染后SSTR4、SSTR5 mRNA表達(dá)的影響。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級2日齡SD大鼠138只，由新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(新)2016-0003，使用許可證：SYXK(新)2016-0002。

1.2試劑醋酸奧曲肽注射液(0.1 g·L-1，批號：S0452，Novartis Pharma Stein AG)；TRNzol 試劑(天根DP405-02)；Bestar qPCR RT Kit、Bestar SYBRGreen qPCR Mastermix(DBI Bioscience公司)；SSTR4抗體、SSTR5抗體(Thermo Fisher公司)；兔二步法免疫組化檢測試劑盒(中杉金橋PV-6001)；氯仿、異丙醇、無水乙醇均為國產(chǎn)分析純。

1.3儀器RETSCH混合冷凍混合球磨儀MM 400(Retsch GmbH公司)；Legend Micro21R高速低溫離心機(jī)(Thermo公司)；Nano Drop 1000核酸定量儀(Thermo Gene公司 )；Gel Doc XR凝膠成像儀(Bio-Rad公司)；QuantStudio 6 Flex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(ABI公司)；尼康Ti熒光倒置顯微鏡(日本Nikon公司)。

2 方法

2.1PI-IBS動(dòng)物模型的建立SD乳鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，按照分層，隨機(jī)將乳鼠分為感染組和非感染組，感染組74只，非感染組64只。感染組通過灌胃給予105隱孢子蟲卵囊混懸液(每只0.1 mL，109·L-1)，未感染組給予等體積磷酸緩沖液。在感染的高峰期即感染后d 7，感染組處死10只乳鼠，取十二指腸、空腸、回腸、結(jié)腸固定，石蠟包埋后，通過HE染色確定是否感染成功。

2.2奧曲肽處理在感染后的11～17 d，給藥對照組和治療組腹腔注射奧曲肽(50 μg·kg-1·d-1)，對照組和感染組給予等量生理鹽水。分別在感染后d 14、17、37、50，每組處死8只大鼠，取2 cm空腸近端組織，其中1 cm組織固定于4%多聚甲醛中，1 cm組織迅速放入液氮后，移至-80℃冰箱保存。

2.3免疫組化法檢測大鼠空腸SSTR4和SSTR5表達(dá)組織固定48 h后，常規(guī)脫水包埋，切片后烤片過夜，切片脫蠟至水，3% H2O2室溫浸泡10 min，蒸餾水洗1次，PBS洗3次。0.01 mol·L-1檸檬酸鹽緩沖液解凍加熱13 min,抗原修復(fù)。PBS洗3次，加60 μL山羊血清覆蓋組織，37℃恒溫箱30 min，棄去多余液體，加60 μL一抗稀釋液(1 ∶1 000), 4 ℃冰箱過夜。次日平衡至室溫，PBS洗5 min×3次，加60 μL二抗,37℃ 30 min，PBS洗5 min×3次，DAB顯色，顯微鏡下控制染色時(shí)間，蘇木精復(fù)染5 min，脫水，透明，封片，200倍顯微鏡觀察，采集圖像。利用Image-pro Plus 6.0 軟件測定樣本的積分光密度值(IOD)。

2.4Realtime-PCR檢測空腸SSTR4、SSTR5mRNA水平稱取50 mg凍存組織提取RNA，用核酸定量儀測定總RNA含量及純度。用1.2%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量。根據(jù)試劑盒操作合成cDNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩８鶕?jù)NCBI GenBank中基因序列，使用Primer premier 6.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物序列見Tab 1。根據(jù)NCBI Primer-BLAST 功能對產(chǎn)物進(jìn)行第1次驗(yàn)證，將合適引物由生工生物工程股份有限公司合成。依據(jù)2-△△CT法分析mRNA的表達(dá)，得到該基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴(kuò)增效率。將樣本cDNA稀釋10倍備用，每個(gè)樣本均為2復(fù)孔?？偡磻?yīng)體系為25 μL，反應(yīng)體系為： SYBR Green qPCR master mix 12.5 μL ,上、下游引物各0.5 μL，DEPC水9.5 μL，ROX 0.05 μL，cDNA 2 μL。反應(yīng)條件為：95℃ 2 min,95℃ 10 s,60℃ 34 s，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)。根據(jù)樣本CT值進(jìn)行相關(guān)計(jì)算，根據(jù)熔解曲線判斷PCR產(chǎn)物是否具有特異性。

Tab 1 Primer sequences used for SSTR4 and SSTR5 detection with real time-PCR

3 結(jié)果

3.1HE染色結(jié)果大鼠感染后d 7的腸道各段進(jìn)行HE染色，與正常組比較，感染組在空腸絨毛部位發(fā)現(xiàn)隱孢子蟲(箭頭所示)，并且絨毛高度降低(紅色直線)，隱窩高度增加(黃色直線)，黏膜層無明顯變化，證明模型構(gòu)建成功(Fig 1)。

Fig 1 HE staining of rat jejunum on d 7 post infection

A: Control group (×200); B: Control group (×400); C: Infection group (×200); D: Infection group (×400)

3.2SSTR4、SSTR5免疫組化結(jié)果大鼠空腸組織在200倍光鏡下，隨機(jī)選取5個(gè)視野，觀察不同時(shí)期SSTR4和SSTR5的表達(dá)。如Fig 2、3所示，SSTR4在感染后d 14、17、50主要表達(dá)部位為隱窩，而感染后d 37，SSTR4主要在黏膜下層表達(dá)。SSTR5在感染后d 14，主要在黏膜下層和腸黏膜部位表達(dá)，感染后d 17、37主要在黏膜下層表達(dá)，而感染后d 50主要在隱窩部位表達(dá)。計(jì)算IOD值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表明，與對照組相比，空腸SSTR4在感染后d 14、17、37明顯增加。在感染后d 14、17、37、50，奧曲肽使SSTR4明顯減少。與對照組比較，空腸SSTR5在感染后d14、17、50表達(dá)增加，而奧曲肽可降低其表達(dá)。

3.3空腸中SSTR4、SSTR5mRNA表達(dá)分析如Fig 4所示，在大鼠空腸中，與對照組相比，感染組在感染后的d 14、17、37、50，空腸SSTR4、SSTR5 mRNA的表達(dá)明顯升高(P<0.01)。給藥對照組空腸SSTR4 mRNA在感染后d 14表達(dá)升高，感染后d 50表達(dá)明顯降低(P<0.01)，給藥對照組SSTR5 mRNA在感染后d 14、17、37表達(dá)升高，感染后d 50表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與感染組相比，感染后d 17、37、50，給藥組空腸SSTR4、SSTR5 mRNA表達(dá)明顯下降(P<0.01)。

4 討論

有研究證實(shí)，生長抑素參與腸道炎癥時(shí)的免疫調(diào)節(jié)[4]。本研究進(jìn)一步證實(shí)了SSTR4和SSTR5在腸道炎癥過程中的變化，以及奧曲肽改善PI-IBS癥狀涉及的可能機(jī)制。隱孢子蟲感染后，空腸的SSTR4、SSTR5分布的組織學(xué)特征與文獻(xiàn)報(bào)道一致[5-7]，免疫組化結(jié)果表明，SSTR5主要表達(dá)在大鼠空腸黏膜下層，SSTR4主要表達(dá)在腸隱窩。有研究報(bào)道，生長抑素的抗炎作用一方面與合成和釋放炎癥介質(zhì)的細(xì)胞有關(guān)，如抑制淋巴細(xì)胞的分化及白介素、干擾素的釋放[1,8]。另一方面，與抑制感覺神經(jīng)末梢釋放炎性多肽有關(guān)[6]。提示生長抑素的神經(jīng)抑制效應(yīng)和鎮(zhèn)痛作用可能更多地與SSTR4有關(guān)。

Fig 2 Expressions of SSTR4 in jejunum determined by immunohistochemistry

A: 14 d post infection; B: 17 d post infection; C: 37 d post infection; D: 50 d post infection; E: Semiquantity of SSTR4 in jejunum determined by Image-pro Plus.*P<0.05,**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsinfection.

本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在隱孢子蟲感染后d 14、17、37、50，SSTR4、SSTR5 mRNA水平都升高。課題組以往研究證實(shí)，感染后d 37、50，大鼠空腸固有層肥大細(xì)胞數(shù)目、上皮淋巴細(xì)胞數(shù)目及黏膜下和肌層神經(jīng)纖維密度都增加，在感染100 d后，空腸對脹氣的敏感性也增加[4]。提示SSTR4、SSTR5 mRNA水平升高早于淋巴細(xì)胞和神經(jīng)元數(shù)目的增加，SSTR4、SSTR5表達(dá)的增加可能與炎癥反應(yīng)有關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了SSTR4和SSTR5參與了腸道感染的免疫反應(yīng)。另外，在感染d 10-17給予奧曲肽(50 μg·kg-1·d-1)，降低了感染后d 17、37、50的SSTR4、SSTR5 mRNA水平。以往研究發(fā)現(xiàn)，奧曲肽可降低感染后d 37、50黏膜肥大細(xì)胞數(shù)目，減少感染后d 50上皮淋巴細(xì)胞數(shù)目及肌層神經(jīng)叢的密度，同時(shí)降低了感染后120 d空腸對脹氣的高敏性[4]。提示奧曲肽的降低痛覺、抗炎作用可能與SSTR4和SSTR5有關(guān)[6]。即使在停藥20 d甚至更長時(shí)間，奧曲肽仍表現(xiàn)出生物學(xué)效應(yīng)，可能奧曲肽改善急性PI-IBS癥狀與SSTRs介導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用有關(guān)。

Fig 3 Expressions of SSTR5 in jejunum determined by immunohistochemistry

A: 14 d post infection; B: 17 d post infection; C: 37 d post infection; D: 50 d post infection; E: Semiquantity of SSTR5 in jejunum determined by Image-pro Plus.**P<0.01vscontrol;#P<0.05,##P<0.01vsinfection.

總之，在隱孢子蟲感染有免疫力的新生乳鼠模型中，空腸SSTR4和STTR5在感染后增加，奧曲肽能不同程度地降低感染后增加的SSTR4和SSTR5水平。提示SSTR4和SSTR5也參與了感染大鼠空腸的免疫調(diào)節(jié)作用。推測可能涉及的下游效應(yīng)與激活肥大細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、黏膜神經(jīng)叢的相互作用有關(guān)[9-11]。今后擬進(jìn)一步在SSTR4和SSTR5基因敲除小鼠模型上，對SSTRs與肥大細(xì)胞之間的相互作用及可能介導(dǎo)的下游細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路做進(jìn)一步研究，以闡明SSTRs在炎癥過程中的作用。

Fig 4 Expression of SSTR4 (A), SSTR5 (B) mRNA in jejunum determined by real time PCR

*P<0.05,**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsinfection.

(致謝: 衷心感謝中國農(nóng)業(yè)大學(xué)索勛教授對本實(shí)驗(yàn)提供隱孢子蟲卵囊。感謝新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院臨床研究院和生物芯片北京國家工程研究中心新疆分中心的呂國棟老師、劉輝老師對實(shí)驗(yàn)提供的無私幫助和技術(shù)指導(dǎo)。)

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