二甲雙胍對(duì)2型糖尿病模型大鼠腎功能及腎組織SIRT1表達(dá)的影響

余 丹，葉山東，李業(yè)瓊，胡 聞

(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院1.內(nèi)分泌科、2.病理科，安徽 合肥 230001)

糖尿病腎臟疾病(diabetic kidney disease，DKD)是一種常見(jiàn)的糖尿病慢性微血管并發(fā)癥，表現(xiàn)為進(jìn)行性白蛋白尿，隨后腎小球?yàn)V過(guò)率(glomerular filtration rate, GFR)逐漸下降，導(dǎo)致腎衰竭伴有足細(xì)胞損失、進(jìn)行性腎小球硬化和腎小管間質(zhì)性纖維化[1]。其發(fā)病與慢性高血糖、炎癥、氧化應(yīng)激、腎小球血流動(dòng)力異常等有關(guān)[2]。二甲雙胍(metformin, MET)是廣泛使用的一線抗糖尿病藥物，近來(lái)研究顯示，其可減少DKD患者的尿蛋白排泄，對(duì)糖尿病腎臟病變有一定的保護(hù)作用，但機(jī)制尚不十分明確[3]。沉默信息調(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1,SIRT1)涉及多種疾病的發(fā)病機(jī)制，包括腎臟疾病[4]。研究顯示，營(yíng)養(yǎng)感受途徑的改變，如雷帕霉素靶蛋白敏感型復(fù)合體1(mammalian target of rapamycin complex 1,mTORC1)、腺苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase, AMPK)、SIRT1與糖尿病腎損傷的發(fā)病機(jī)制有關(guān)[5]。在營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩的條件下，mTORC1、AMPK活化和SIRT1的活化減少，可能抑制自噬，而自適應(yīng)自噬可以對(duì)抗糖尿病狀態(tài)下的細(xì)胞應(yīng)激，保護(hù)腎實(shí)質(zhì)細(xì)胞[6]。本研究觀察二甲雙胍對(duì)2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)大鼠腎組織SIRT1表達(dá)的影響，初步探討二甲雙胍對(duì)T2DM大鼠腎臟組織的保護(hù)作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)8 周齡♂ SD 大鼠，體質(zhì)量180～220 g，購(gòu)自安徽醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心。所有動(dòng)物自由飲食和飲水，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間濕度48%，室溫控制為(19±1)℃，照明、黑暗12 h交替。

1.1.2藥物與試劑 二甲雙胍購(gòu)自上海施貴寶公司；鏈脲佐菌素(streptozocin, STZ)購(gòu)自Sigma公司；白蛋白放射免疫試劑盒購(gòu)自天津市協(xié)和公司；肌酐、尿素氮試劑盒購(gòu)自南京建成科技公司；TRIzol、引物和PCR試劑盒購(gòu)自大連TaKaRa公司；格列本脲(glibenclamide, GLY)購(gòu)自天津太平洋公司；SIRT1免疫組化試劑盒購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；尿SIRT1 ELISA試劑盒購(gòu)自上海艾來(lái)薩生物科技公司。

1.1.3儀器 DG-3022A型酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀(江蘇南京國(guó)營(yíng)華東電子管廠)；DFM-96型10管放射免疫計(jì)數(shù)儀(安徽合肥眾成機(jī)電公司)；DS-5型糖化血紅蛋白檢測(cè)儀(英國(guó)DREW公司)；NDl000紫外/分光光度儀(美國(guó)Nano-Drop公司)；ABI7500型擴(kuò)增儀(美國(guó)Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1T2DM大鼠模型的建立、分組及給藥 44只SD大鼠，隨機(jī)分為正常組10只和模型組34只。正常組大鼠給予普通飼料飼養(yǎng)，模型組大鼠給予高脂飼料(含88%常規(guī)飼料、10%豬油、2%膽固醇) 。飼養(yǎng)4周后，禁食不禁水12 h，然后腹腔注射STZ(30 mg·kg-1)建立T2DM大鼠模型。造模72 h后，大鼠禁食不禁水8 h，尾靜脈采血測(cè)定血糖≥16.7 mmol·L-1為造模成功。共30只造模成功，隨機(jī)分為糖尿病組、二甲雙胍(300 mg·kg-1·d-1) 治療組和格列本脲組(5 mg·kg-1·d-1)，每組均為10 只，灌胃給藥，每天1次，連續(xù)8 周，T2DM大鼠繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

1.2.2標(biāo)本的采集 干預(yù)治療8周后，用代謝籠收集12 h尿液，混勻后留取尿液5 mL，置于-40℃冰箱中，待測(cè)尿肌酐、尿SIRT1和尿白蛋白。收集尿標(biāo)本后，各組大鼠在10%的水合氯醛腹腔注射麻醉下，行腹主動(dòng)脈插管采集血標(biāo)本，待測(cè)血糖(blood glucose，BG)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c，HbA1c)。取出大鼠的雙腎組織，用生理鹽水反復(fù)灌洗，去除包膜，右腎部分組織放置于液氮中保存，留做real-time PCR，其余腎臟組織用來(lái)觀察腎臟的病理變化。

1.3檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.3.1生化指標(biāo)的檢測(cè) 尿肌酐檢測(cè)使用苦味酸比色法，尿SIRT1檢測(cè)采用ELISA法，血尿素氮檢測(cè)使用尿酶法，尿白蛋白檢測(cè)使用放射免疫分析法。尿SIRT1及尿白蛋白排泄取其與尿肌酐的比值來(lái)表示，以排除尿液稀釋的影響，表示為尿SIRT1 肌酐比(urinary SIRT1/urine creatinine，USIR)和尿白蛋白肌酐比(urinary albumin/urine creatinine, UACR)。

1.3.2免疫組化檢測(cè)腎組織SIRT1蛋白表達(dá) 石蠟切片脫蠟水化；滴加3% H2O2，在室溫下孵育15 min，以阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶；用PBS沖洗5 min×3 次；滴加10%的正常山羊血清封閉液，置于室溫下20 min；滴加一抗(SIRT1稀釋濃度為1 ∶200)，4℃冰箱過(guò)夜；次日用PBS洗3 min×3次；滴加二抗，放置于37℃溫箱內(nèi)孵育30 min，用PBS清洗3 min×3次；用DAB顯色；自來(lái)水沖洗，復(fù)染后脫水至透明，封片。每張切片選取3個(gè)視野拍照，采用全自動(dòng)圖像分析系統(tǒng)(Image Pro Plus 6.0)測(cè)定圖像陽(yáng)性反應(yīng)部分的面積及相應(yīng)的累積光密度(integral optical density , IOD)，選取各切片陽(yáng)性物質(zhì)的相對(duì)含量，用SIRT1IOD表示。

1.3.3Real-time PCR法檢測(cè)腎組織SIRT1 mRNA表達(dá) 用TRIzol法提取腎組織RNA，提取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，產(chǎn)物分別進(jìn)行SIRT1及β-actin的擴(kuò)增。SIRT1引物序列為上游：5′-TGTTTCCTGTGGGATACCTGA-3′，下游：5′-TGAAGAATGGTCTTGGGTCTTT-3′；β-actin引物序列為上游：5′-GCCTTAGCCTGGACCCATAG-3′，下游：5′-GACCACCAATCCACACAGA-3′。使用ABI7500型擴(kuò)增儀，在20 μL反應(yīng)體系下運(yùn)用熒光染料法，95℃預(yù)變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火34 s，72℃延伸1 min的熱循環(huán)40次；95℃15 s、60℃ 1 min及95℃ 15 s循環(huán)1次。內(nèi)參和目的片段分別同批擴(kuò)增，每組同時(shí)設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，采用ΔΔCt法分析Ct值, 2-ΔΔCt表示目的基因mRNA表達(dá)的拷貝數(shù)與β-actin拷貝數(shù)之比。

Tab 1 Biochemical indicators after 8 weeks of intervention in n=10)

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsT2DM group;△P<0.05vsMET group

1.3.4電鏡觀察 取部分腎皮質(zhì)在2.5%戊二醛室溫下固定30 min，制作成超薄切片，在10 000倍下采取10個(gè)視野，并隨機(jī)選取8處，測(cè)量腎小球基底膜厚度(glomerular basement membrane thickness, GBMT)，求其平均值。電子顯微鏡下觀察腎小球足細(xì)胞形態(tài)。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般生化指標(biāo)的比較8周末，與正常組比較，各組T2DM大鼠的血HbA1c、BG、BUN、USIR、UACR水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與T2DM組比較，MET組和GLY組上述指標(biāo)明顯降低(P<0.05)，但高于NC組(P<0.05)。MET組與GLY組之間BG和HbA1c值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，BUN、USIR和UACR差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)Tab 1。

2.2各組大鼠腎組織SIRT1蛋白表達(dá)的變化Fig 1、Tab 2免疫組化結(jié)果顯示，NC組腎組織SIRT1表達(dá)最多，其余各組SIRT1IOD水平均減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與T2DM組比較，MET組及GLY組SIRT1蛋白表達(dá)水平增加(P<0.05)，MET組SIRT1蛋白表達(dá)高于GLY組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3各組大鼠腎組織SIRT1mRNA表達(dá)的變化Real-time PCR結(jié)果顯示，NC組腎組織SIRT1 mRNA表達(dá)最多，其余各組SIRT1 mRNA水平均減少，且差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；MET組和GLY組腎組織SIRT1 mRNA表達(dá)明顯高于T2DM組(P<0.05)，且MET組SIRT1 mRNA表達(dá)高于GLY組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)Tab 2。

Fig1ExpressionofSIRT1inrenaltissuesofeachgroup(×400)

A: NC group; B: T2DM group; C: MET group; D: GLY group

2.4各組大鼠腎組織病理學(xué)變化Fig 2電鏡下可見(jiàn)，NC組腎臟結(jié)構(gòu)清晰，足突無(wú)融合，GBM厚薄均勻；T2DM組GBMT明顯增厚，與NC組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，且足突融合，結(jié)構(gòu)模糊不清；MET組和GLY組GBMT較T2DM組明顯減低(P<0.05)，足突融合明顯改善；GLY組與MET組GBMT差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)Tab 2。

Tab 2 Comparison of GBMT and expression of mRNA and protein of SIRT1 after 8 weeks of intervention in rats n=10)

*P<0.05vsNC group;#P<0.05vsT2DM group;△P<0.05vsMET group

3 討論

SIRT1是長(zhǎng)壽蛋白(Surtuin)家族的一員[7]，是一種煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adeninedinucleotide, NAD+)依賴(lài)性脫乙酰酶，在調(diào)節(jié)胰島素信號(hào)和代謝率、控制胰島素敏感性、脂肪儲(chǔ)存代謝及葡萄糖利用等方面都起著高度保守的作用[8]。SIRT1參與許多細(xì)胞的代謝，并涉及人類(lèi)疾病(如肥胖、T2DM、癌癥、神經(jīng)變性疾病)的發(fā)生發(fā)展[9]。Kume等[5]證實(shí)，在糖尿病狀態(tài)下，代謝障礙可通過(guò)激活mTORC1的靶標(biāo)以及減少AMPK和SIRT1活性而損害自噬作用。下調(diào)腎臟中SIRT1的表達(dá)可抑制自噬，導(dǎo)致線粒體活性氧(reactive oxygen species，ROS)的積聚，參與糖尿病腎病的發(fā)生[7]。文獻(xiàn)報(bào)道，SIRT1可能通過(guò)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子如p53的活性，保護(hù)腎小球足細(xì)胞[10]。Bao等[3]證實(shí)，激活線粒體AMPK-SIRT1-過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ共激活因子α(peroxisome proliferators activated receptor gamma co-activator 1α, PGC-1α)信號(hào)通路，可緩解高脂飲食所致的糖尿病模型大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激和線粒體破壞，并增加腎臟腎病蛋白和足細(xì)胞標(biāo)志蛋白的表達(dá)，SIRT1激活可阻止腎細(xì)胞凋亡，抑制炎癥和纖維化[7]。

Fig 2 The pathological changes in kidneys of rats after 8 weeks of intervention observed under electron microscope (×10 000)

A: NC group; B: T2DM group; C: MET group; D: GLY group

二甲雙胍是一線抗糖尿病藥物，Caton等[11]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可增加肝組織SIRT1蛋白表達(dá)和活性，抑制TORC2介導(dǎo)的糖異生。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)二甲雙胍及格列本脲干預(yù)8周后，MET組和GLY組BUN、UACR和GBMT均低于T2DM組，足細(xì)胞病理改變減輕，且MET組低于GLY組，但兩組血糖和HbA1c無(wú)明顯的差異，提示二甲雙胍在降血糖作用相似的情況下，其腎臟保護(hù)作用較格列本脲更具優(yōu)勢(shì),部分獨(dú)立于血糖的降低。進(jìn)一步觀察顯示，糖尿病模型組大鼠腎組織SIRT1蛋白和mRNA表達(dá)明顯降低，MET和GLY干預(yù)治療后，可明顯增加腎組織SIRT1表達(dá)，且二甲雙胍優(yōu)于格列本脲。提示二甲雙胍可上調(diào)T2DM大鼠腎組織SIRT1蛋白和mRNA的表達(dá)，進(jìn)而對(duì)腎臟提供一定的保護(hù)作用。MET增加腎組織SIRT1表達(dá)的機(jī)制尚不十分明確，可能與其抑制炎癥反應(yīng)、減輕氧化應(yīng)激和誘導(dǎo)自噬有關(guān)。Tsuruoka等[12]發(fā)現(xiàn)，高血糖狀態(tài)下足細(xì)胞SIRT1和PGC-1α的表達(dá)減少，導(dǎo)致線粒體損傷。二甲雙胍激活A(yù)MPK/SIRT1旁路，減輕氧化應(yīng)激，降低NAD+/NADH比值，從而增加SIRT1活性[11,13]。此外，二甲雙胍也可直接刺激SIRT1的表達(dá)和增加其活性，并通過(guò)調(diào)節(jié)SIRT1下游靶標(biāo)叉頭轉(zhuǎn)錄因子(Forkhead box O1，F(xiàn)oxO1)和p53/p21，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞[14]，激活SIRT1/ FoxO1通路，致線粒體氧化應(yīng)激降低[15]。Zheng等[16]報(bào)道了視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞在高血糖條件下，二甲雙胍直接或部分通過(guò)肝激酶B1(liver kinase B1，LKB-1)/AMPK通路，增加SIRT1水平/活性，從而抑制ROS產(chǎn)生、NF-κB的激活以及Bax誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。并且，二甲雙胍治療恢復(fù)SIRT1表達(dá)，可通過(guò)蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)獨(dú)立的途徑誘導(dǎo)自噬[17]。本研究結(jié)果顯示，二甲雙胍干預(yù)組尿SIRT1蛋白排泄明顯降低，有待進(jìn)一步觀察。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步結(jié)果顯示二甲雙胍可降低糖尿病大鼠腎組織SIRT1蛋白和mRNA的表達(dá)，該結(jié)果可能與其腎臟保護(hù)作用有關(guān)。

(致謝: 本研究在安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院糖尿病研究室和病理科完成，在此致以由衷的感謝! )

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