海南山竹果實不同部位多酚提取物抗氧化活性、乙酰膽堿酯酶和α-葡萄糖苷酶抑制活性研究

譚 琳，周兆禧，王甲水，馬伏寧，康由發(fā)

（1.中國熱帶農(nóng)業(yè)科學院海口實驗站/海南省香蕉遺傳改良重點實驗室，海南 ?？?570102；2.海南大學城西校區(qū)管委會，海南 ?？?571101）

乙酰膽堿是參與學習記憶等生理活動的一種重要神經(jīng)遞質(zhì)。乙酰膽堿酯酶抑制劑能夠抑制乙酰膽堿酯酶的活性，提高腦內(nèi)乙酰膽堿的水平，從而延緩阿爾次海默癥病情的發(fā)展［1］。α-葡萄糖苷酶抑制劑可競爭性抑制小腸內(nèi)各種α-葡萄糖苷酶活性，降低餐后血糖水平的升高，可用于糖尿病的治療［2］。近年研究發(fā)現(xiàn)，一些水果多酚在具有抗氧化性的同時，還能夠抑制乙酰膽堿酯酶或α-葡萄糖苷酶的活性［3］，這為人們通過膳食預(yù)防或治療阿爾次海默癥和糖尿病等慢性疾病提供了理論依據(jù)。因此，對水果中的功能因子進行相關(guān)活性評價，已經(jīng)成為果品營養(yǎng)學研究的熱點。

山竹（Garcinia mangostana）也稱鳳果、倒稔子或莽吉柿，是一種藤黃科藤黃屬熱帶水果，廣泛分布于馬來西亞、泰國、印度尼西亞和菲律賓等東南亞國家［4-5］，目前在我國臺灣、廣東、廣西、云南和海南等地也有種植。山竹果重55～75 g，果肉白色透明，果實可食部分占29%～45%，不僅味道鮮美，而且營養(yǎng)豐富，含有多種氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪 、維生素B以及豐富的礦物質(zhì)和微量元素［6］。山竹果皮作為傳統(tǒng)醫(yī)藥，被廣泛用于治療腹痛、腹瀉、痢疾、感染性創(chuàng)傷、化膿、慢性潰瘍等疾?。?］。近年來，人們對山竹果皮中的多酚及其化學成分開展了大量的抗氧化［8］、防癌［9］、抑菌［10］和抗癌活性評價［11］，但是對山竹果肉多酚的抗氧化活性、乙酰膽堿抑制活性和α-葡萄糖苷酶抑制活性的報道極少，且產(chǎn)地不同的山竹其果皮多酚的含量及生物學活性可能存在差異。為此，本研究對海南山竹果肉和果皮的多酚含量、多酚的抗氧化活性以及乙酰膽堿酯酶和α-糖苷酶的抑制活性進行了測定，為引導(dǎo)山竹消費提供理論依據(jù)，為山竹的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試山竹果實于2014年10月30日采自海南省五指山毛道鄉(xiāng)山竹果園。

主要試劑：沒食子酸（gallic acid，GA），為阿拉丁試劑上海有限公司產(chǎn)品；乙酰膽堿酯酶（acetylcholine esterase）、5，5’-二硫代雙（2-硝基苯甲酸）（dithiobisnitrobenzoicacid，DTNB）、碘化硫代乙酰膽堿（acetylthiocholine iodide，ATCI）、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside，PNPG）、α-葡萄糖苷酶，購自美國Sigma公司。

儀器與設(shè)備：UV-1800紫外-可見分光光度計（日本島津公司）、Thermo Multiskan FC全自動酶標儀（美國Thermo Scientific 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 山竹果皮和果肉多酚的提取 將山竹果皮和果肉分離，40℃烘干后粉碎，過孔徑245 μm篩。稱取2.5 g樣品，加入95%乙醇100 mL，微波輔助提?。?00 MHz，40℃）3 h，過濾，濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后，得到山竹果皮和果肉浸膏（多酚提取物）。

1.2.2 總酚含量的測定 采用Singleton等［12］的福林-酚比色法。將山竹果皮和果肉浸膏用無水乙醇配制成濃度為1 mg/mL的樣品，取0.2 mL樣品和 0.5 mL雙蒸水、125 μL的Folin-Ciocalteu試劑反應(yīng)6 min后，加入4 mL 2%（W/V）碳酸鈉溶液及1 mL雙蒸水，暗處反應(yīng)90 min后，760 nm波長處檢測吸光度?？偡雍坑脹]食子酸為標準進行定量，最終的山竹果皮和果肉總酚含量用每克干粉所含有的沒食子酸當量表示（mg GAE/g）。

1.2.3 羥自由基（·OH）清除能力的測定 參照陳健等［13］的方法，將山竹果皮和果肉浸膏用雙蒸水配制成濃度為0.25～4 mg/mL的樣品。在試管中依次加入1 mL 0.75 mmol/L鄰二氮菲溶液、1 mL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液、1 mL雙蒸水、1 mL 0.75 mmol/L硫酸亞鐵溶液，充分混勻后，加入1 mL 0.01% 過氧化氫，37℃水浴1 h，在536 nm波長處測吸光度（A損，損傷管），以Vc作為陽性對照。IC50值為自由基清除率達到50%時的樣品濃度，·OH清除率計算公式如下：

式中，A空為用雙蒸水代替A損反應(yīng)中的過氧化氫時的吸光度；A樣為用樣品代替A損反應(yīng)中的雙蒸水時的吸光度。

1.2.4 DPPH自由基清除能力的測定 參照文獻［14］的方法，將山竹果皮和果肉浸膏用無水乙醇配制成0.25～4 mg/mL的樣品，取0.2 mL樣品溶液和2 mL含0.1 mmol/L DPPH的95%乙醇在室溫反應(yīng)30 min，517 nm波長處測定吸光度。DPPH清除率計算公式如下：

式中，Ai為樣品吸光度，Ac為對照吸光度，Aj為樣品本底吸光度。

1.2.5 ABTS自由基清除能力的測定 采用鄭曉燕等［15］的方法，將山竹果皮和果肉多酚浸膏用雙蒸水配制成濃度為0.25～6 mg/mL的溶液，取0.2 mL各濃度樣品和1.9 mL ABTS+·工作液反應(yīng)6 min，于 734 nm波長處量取吸光度（Ai），以Vc作為陽性對照，計算ABTS+·清除率：

式中，Aj為以雙蒸水取代ABTS+·工作液反應(yīng)體系的吸光度，A0為以雙蒸水取代樣品溶液反應(yīng)體系的吸光度。

1.2.6 乙酰膽堿酯酶抑制活性的測定 采用文獻［16-17］的方法，并稍作改動。將山竹果皮和果肉浸膏用PBS配制成62.5～1 000 μg/mL的樣品，在96 孔板中依次加入50 μL PBS、25 μL樣品、25 μL乙酰膽堿酯酶（1.0 μg/mL），4℃放置20 min，然后加入25 μL ATCI （0.30 mg/mL）、125 μL DTNB（0.59 mg/mL），37℃孵育20 min，以石杉堿甲為陽性對照，在405 nm波長處測定吸光度。計算乙酰膽堿酯酶活性抑制率：1.2.7 α-糖苷酶抑制活性的測定 參照朗國竣［18］的方法，將山竹果皮和果肉浸膏用PBS配制成1～5 mg/mL的樣品，在96 孔板中依次加入 90 μL PBS緩沖液、20 μL 0.57 U/mL α-葡萄糖苷酶、10 μL 3 mmol/L谷胱甘肽溶液、20 μL樣品，37℃反應(yīng)15 min后，加入10 mmol/L PNPG 40 μL，37℃反應(yīng)15 min，于405 nm波長處測定吸光度。同時設(shè)定相同條件下樣品空白對照、陰性對照、空白對照以及以阿卡波糖為抑制劑的陽性對照。按下式計算α-糖苷酶活性抑制率，并求出相應(yīng)IC 值：

采用Excel 2007繪制曲線，利用Excel中的FORECAST命令，通過線性回歸方程，返回一個預(yù)測值，計算IC50値，使用SPSS19.0分析數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 山竹果皮、果肉總酚含量

采用福林-酚比色法測定了山竹果皮、果肉的總酚含量，沒食子酸對照品在20～100 μg的范圍內(nèi)線性良好，標準曲線方程為Y=0.0008X + 0.0559（R2= 0.997），測定獲得的山竹果皮中的多酚含量為21.36 mg/g（干重），山竹果肉多酚為0.388 mg/g（干重）。

2.2 山竹果皮、果肉多酚的·OH清除能力

從圖1可以看出，當山竹果皮多酚濃度為50 μg/mL時，清除率已達51.8（±1.41）%。隨著濃度的增加，清除活性也逐漸上升。當濃度為200 μg/mL時，清除率達95.66（±1.74）%，與對照Vc相比，其清除能力更強（P＜0.05）。山竹果皮多酚清除·OH的IC50值為37.39（±3.63） μg/mL。山竹果肉多酚在濃度為50 μg/mL時，對·OH的清除能力很弱，僅為5.72（±0.14）%，但是其清除能力表現(xiàn)出隨濃度增加而增強的趨勢。在山竹果肉多酚濃度為800 μg/mL時，其清除活性達50.37（±1.13）%。

圖1 山竹果皮、果肉多酚的·OH清除活性

2.3 山竹果皮、果肉多酚的DPPH自由基清除能力

由圖2可知，當山竹果皮多酚濃度為25 μg/mL時，其清除 DPPH的活性為27.82（±1.28）%，隨著濃度的增大，山竹果皮多酚對DPPH自由基的清除活性明顯增強，當山竹果皮多酚濃度達到100 μg/mL時，其對DPPH自由基清除率達到86.75（±1.72）%。之后隨著濃度增加，清除能力逐漸達到飽和。山竹果皮多酚對DPPH自由基的清除能力與Vc的清除能力沒有顯著差異。其清除DPPH自由基的IC50值為46.34（±1.35） μg/mL。相對而言，山竹果肉多酚清除 DPPH自由基的能力較弱，當其濃度為400 μg/mL時，清除活性僅為20.37（±0.83）%，與Vc相比有極顯著差異。

圖2 山竹果皮、果肉多酚的DPPH自由基清除活性

2.4 山竹果皮、果肉多酚的ABTS+·清除能力

從圖3可以看出，當山竹果皮多酚濃度為25 μg/mL時，對ABTS+·的清除能力為30.52（±1.28）%。隨著濃度的增加，其ABTS+·清除能力逐漸增強，當濃度為100 μg/mL時，山竹果皮多酚對ABTS+·的清除率達90.52（±1.2）%，與Vc的ABTS+·清除能力相當。山竹果皮多酚清除ABTS+·的IC50為41.37（±0.98）μg/mL。山竹果肉多酚濃度為25 μg/mL時，對ABTS+·清除活性為12.02（±0.81）%。隨著濃度的增加，清除活性也隨之增加。當濃度為600 μg/mL時，其清除活性達65.41（±1.21）%。與山竹果皮多酚和Vc相比有顯著差異，其IC50為361.96（±17.58） μg/mL。

圖3 山竹果皮、果肉多酚的ABTS+· 清除活性

2.5 山竹果皮、果肉多酚的乙酰膽堿酯酶抑制活性

從圖4可以看出，當山竹果皮多酚濃度為25 μg/mL時，對乙酰膽堿酯酶活性的抑制率達到51.5（±1.14）%。當濃度為100 μg/mL時，其抑制率達87.18（±2.4）%，其 IC50為29.46（±0.25） μg/mL。山竹果肉多酚對乙酰膽堿酯酶抑制活性較弱，濃度為100 μg/mL時抑制率僅為20.87（±0.89）%。在一定濃度范圍內(nèi)，抑制率呈現(xiàn)濃度依賴效應(yīng)，但活性低，與陽性對照石杉堿甲相比有極顯著差異。

圖4 山竹果皮、果肉多酚的乙酰膽堿酯酶抑制活性

2.6 山竹果皮、果肉多酚的α-葡萄糖苷酶抑制活性

從圖5可以看出，當山竹果皮多酚濃度為1 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶抑制活性達89.74（±2.2）%，表現(xiàn)出比陽性對照阿卡波糖更強的抑制活性（P＜0.05）。隨著質(zhì)量濃度的增加，抑制活性略有增強并趨于飽和，其IC50為7 μg/mL。山竹果肉多酚在濃度為1 mg/mL時，對α-葡萄糖苷酶抑制活性為32.17（±0.83）%。隨著濃度增加，抑制活性也上升。當濃度為2 mg/mL時，抑制活性達52.2（±1.39）%，其IC50為 2.24（±0.06） mg/mL。

圖5 山竹果皮、果肉多酚的α-葡萄糖苷酶酶抑制活性

3 討論

本研究以體積分數(shù)95%的乙醇提取了產(chǎn)自海南山竹的果皮和果實多酚，F(xiàn)olin-酚法測定其總酚含量分別為21.36、0.388 mg/g（干重）。山竹果皮多酚對·OH、DPPH自由基和ABTS+·均具有良好的清除活性，并且呈現(xiàn)濃度依賴性，IC50值分別為37.39（±3.63）、41.34（±1.55）、41.37（±0.98） μg/mL。陶鈺等［19］從廣西市售的山竹果皮提取的多酚對·OH 、DPPH自由基清除能力的IC50值分別為55.1（±0.7）、32.5（±0.5） μg/mL。張曉南等［20］從哈爾濱市售山竹果皮中提取的多酚物質(zhì)清除DPPH·自由基IC50值為15.69 μg/mL，表明海南山竹果皮多酚的抗氧化活性與其他地區(qū)的相比差異不大。

海南山竹果皮多酚還具有顯著的α-糖苷酶抑制活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性，這可能與果皮中含有的氧雜蒽酮有關(guān)。研究顯示，氧雜恩酮是山竹中的主要活性成分，在植物營養(yǎng)素家族中有著強大的抗氧化能力，而α-倒捻子素是其中一種最重要的天然氧雜蒽酮衍生物之一，具有良好的α-糖苷酶活性抑制［21］。Khaw等［22］研究發(fā)現(xiàn)，山竹果皮中的異戊烯基氧雜蒽酮類化合物具有乙酰膽堿酯酶抑制活性。

山竹果肉多酚對·OH、DPPH自由基和ABTS+·的清除活性顯著低于山竹果皮多酚，其酚含量也遠低于山竹果皮酚含量，這表明山竹的酚含量與其抗氧化活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性和α-糖苷酶抑制活性有密切關(guān)系。

綜上，本試驗體外研究表明，海南山竹果皮多酚具有強抗氧化性、乙酰膽堿酯酶抑制活性和α-糖苷酶抑制活性；山竹果肉多酚也具有一定的抗氧化性和乙酰膽堿酯酶抑制活性以及中等程度的α-糖苷酶抑制活性，但它們在體內(nèi)是否能夠發(fā)揮同樣的效應(yīng)尚不得而知。因此，有必要進一步通過體內(nèi)實驗驗證山竹果皮、果肉多酚的抗氧化活性、乙酰膽堿酯酶抑制活性和α-糖苷酶抑制活性。

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