大鼠腰椎終板軟骨干細(xì)胞的分離與鑒定

王 效,肖 良,徐宏光,金中行

(皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 脊柱外科，安徽 蕪湖 241001)

椎間盤由上下邊界椎體終板、中間由外到內(nèi)依次是纖維環(huán)和髓核組成，其退變是由負(fù)荷、年齡、外傷等多種因素介導(dǎo)的慢性過程，可以引起椎間隙狹窄、運(yùn)動階段失穩(wěn)、小關(guān)節(jié)退變，進(jìn)而引起神經(jīng)卡壓和刺激，進(jìn)一步導(dǎo)致臨床上的腰腿痛和下腰痛癥狀。臨床上內(nèi)科治療多以理療為主，外科手術(shù)雖然能解決終末期癥狀，但是無法改變脊柱在壓力負(fù)荷下的退變進(jìn)程。本文利用干細(xì)胞自身生長特點(diǎn)，采用單克隆法培養(yǎng)出細(xì)胞集落，通過成骨、成脂肪及成軟骨的三向誘導(dǎo)，證明了該集落具有干細(xì)胞性質(zhì)，為椎間盤退變的治療提供了新思路。運(yùn)用干細(xì)胞治療椎間盤退變不僅能維持脊柱正常的受力形態(tài)，而且能大幅度減少手術(shù)造成的創(chuàng)傷，具有巨大的潛力和社會經(jīng)濟(jì)效益。

1 材料與方法

1.1 主要材料 0.05%透明質(zhì)酸酶，0.25%EDTA-胰酶(Gibco)，0.2%二型膠原酶(Sigma),DMEM/F12(Gebico),干細(xì)胞血清(雙洳)，地塞米松，胰島素，吲哚美辛，β-磷酸甘油,L-抗壞血酸-2-磷酸酯,甲基異丁基黃嘌呤(IBMX),脯氨酸,丙酮酸鈉,胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸混合物,腫瘤生長因子-b3。油紅O染色劑，茜素紅染色劑，甲苯胺藍(lán)染色劑，10 cm培養(yǎng)皿。

1.2 方法

1.2.1 大鼠腰椎終板軟骨原代細(xì)胞的獲取 取4周齡大鼠幼鼠1只，給予頸椎脫臼法處死后，全部浸沒于75%的酒精10 min，無菌條件下分離大鼠幼鼠腰椎L1～L5，解剖顯微鏡下分離終板軟骨(圖1)，然后將分離到的軟骨浸泡在含有雙抗的PBS中10 min，取出后PBS沖洗3次，剪碎至1 mm×1 mm×1 mm大小。先加入0.05%的透明質(zhì)酸酶，室溫下作用20 min。1000 r/min離心5 min后棄上清，加入0.25%EDTA-胰酶，置于37℃溫水浴箱中40 min后再次離心并棄上清，最后加入0.2%二型膠原酶，重新置于水浴箱中消化5 h左右，每30 min震蕩一次以加速消化。待組織完全消化后用200目濾網(wǎng)過濾，1500 r/min離心5 min，棄上清，重新加入培養(yǎng)基吹打混勻，備用。

圖1 新生4周齡大鼠幼鼠的脊柱標(biāo)本

1.2.2 單克隆法獲取腰椎終板軟骨干細(xì)胞(stem cells derived from the lumbar endplate cartilage，EPCSCs) 單克隆法已經(jīng)證實(shí)可以獲得間充質(zhì)干細(xì)胞[1]及人纖維環(huán)干細(xì)胞[2]。是否能成功運(yùn)用此法提取EPCSCs尚未知，故我們按照50、100、200、300個/cm2把細(xì)胞接種到10 cm培養(yǎng)皿中并培養(yǎng)10 d，PBS沖洗1遍后用4%的多聚甲醛固定30 min，繼續(xù)用PBS沖洗2遍后用0.1%的結(jié)晶紫染色，并計(jì)算細(xì)胞集簇形成數(shù)目。

1.2.3 成骨方向誘導(dǎo)分化 將用單克隆法得到的細(xì)胞，用0.25%EDTA-胰酶消化后，按照2×104個/孔的密度接種于24孔板中，待24 h細(xì)胞貼壁后，將一般培養(yǎng)基更換為誘導(dǎo)成骨分化的培養(yǎng)基(包含10% FBS、100 nmol/L地塞米松、10 mmol/L β-磷酸甘油和50 μmol/L L-抗壞血酸-2-磷酸酯)。每3 d換一次液，連續(xù)誘導(dǎo)2～3周后用茜素紅染色。

1.2.4 成軟骨方向誘導(dǎo)分化 按照Micromass法[3]進(jìn)行成軟骨方向分化，按照2×104個/孔的密度接種于24孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)80%時，加入誘導(dǎo)軟骨分化培養(yǎng)基(包含10% FBS、1%ITS、100 nmol/L地塞米松、50 mg/L L-抗壞血酸-2-磷酸酯和10 μg/L重組人 TGFβ1)，每3 d換液1次，持續(xù)誘導(dǎo)3周后用甲苯胺藍(lán)染色。

1.2.5 成脂肪方向誘導(dǎo)分化 按照2×104個/孔的密度接種于24孔板中，待細(xì)胞融合達(dá)80%～90%時，加入誘導(dǎo)脂肪分化培養(yǎng)基(包含10% FBS、500 μmol/L甲基異丁基黃嘌呤、1 μmol/L地塞米松、60 μmol/L吲哚美辛和 5 mg /L胰島素)，誘導(dǎo)3 d，然后更換為維持脂肪分化培養(yǎng)基(包含 10% FBS、10 mg/L胰島素)，誘導(dǎo)1 d，然后再更換為誘導(dǎo)脂肪分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)3 d，如此循環(huán)3個周期后用油紅O染色，蘇木素復(fù)染后鏡下觀察。在此需注意的是將原代融合80%～90%時更利于脂肪誘導(dǎo)分化，2種不同類型的培養(yǎng)基更換時不要使細(xì)胞處于無培養(yǎng)基狀態(tài)。

1.2.6 單克隆形成能力檢測 單克隆形成能力是干細(xì)胞的一個重要特性，為了驗(yàn)證經(jīng)過單克隆法獲取的細(xì)胞集落是否具有這一性質(zhì)，將原代獲得的細(xì)胞集落用酶消化法消化后，按照100、200、300個/cm2細(xì)胞接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，一式三份，加入培養(yǎng)基培養(yǎng)10～12 d，然后用0.1%結(jié)晶紫染色，計(jì)數(shù)肉眼能觀察到的細(xì)胞集簇。

2 結(jié)果

2.1 單克隆法提取EPCSCs 結(jié)果顯示：當(dāng)大鼠腰椎終板軟骨細(xì)胞接種在10 cm培養(yǎng)皿后，大部分細(xì)胞在2～3 d之內(nèi)仍保持原來形態(tài)，可見極少數(shù)細(xì)胞貼壁。在單克隆3 d后，可見培養(yǎng)皿中有細(xì)胞集簇形成，5 d后，集簇明顯，且大體形態(tài)呈梭形，細(xì)胞排列有序。培養(yǎng)10 d后細(xì)胞接近融合，此時進(jìn)行傳代培養(yǎng)。結(jié)晶紫染色可見細(xì)胞集簇，按照大于20個/簇的標(biāo)準(zhǔn)計(jì)數(shù)，發(fā)現(xiàn)以200個/cm2的密度接種時，細(xì)胞集簇形成最多(圖2)。

A.原代細(xì)胞經(jīng)單克隆法培養(yǎng)后形成的細(xì)胞集落;B.3 d后觀察集落形成(400×);C.5 d后可見明顯細(xì)胞集落。

圖2 單克隆法提取EPCSCs

2.2 腰椎終板軟骨細(xì)胞與干細(xì)胞的形態(tài)比較 在倒置相差顯微鏡下，剛接種的軟骨細(xì)胞呈圓形，培養(yǎng)24 h后貼壁，呈圓形或橢圓形，繼續(xù)培養(yǎng)后呈不規(guī)則四角形或者三角形，類似鋪路石樣。而經(jīng)過單克隆培養(yǎng)獲得的細(xì)胞，細(xì)胞整體形態(tài)較軟骨細(xì)胞小，多呈橢圓形或梭形，且細(xì)胞排列方向一致(圖3)。

2.3 成骨誘導(dǎo)分化 經(jīng)過2～3周的成骨誘導(dǎo)后，實(shí)驗(yàn)組和對照組經(jīng)過茜素紅染色，顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過單克隆培養(yǎng)獲得的細(xì)胞可以形成鈣結(jié)節(jié)而被染成紅色，對照組無鈣結(jié)節(jié)而不著色(圖4)。

A.軟骨細(xì)胞正常培養(yǎng)甲苯胺藍(lán)染色(400×);B.細(xì)胞集落高倍鏡下形態(tài)(400×)。

圖3 成骨誘導(dǎo)分化

圖4 成骨誘導(dǎo)后實(shí)驗(yàn)組與對照組經(jīng)茜素紅染色后對比(400×)

2.4 成脂肪誘導(dǎo)分化 經(jīng)過21 d的成脂肪誘導(dǎo)，顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞上方出現(xiàn)較明顯的脂肪滴，經(jīng)油紅O染色后，可見脂肪滴被染成紅色，分布在細(xì)胞內(nèi)。對照組無染色(圖5)。

成脂肪誘導(dǎo)后可見脂肪滴形成，油紅O染色及蘇木素復(fù)染后鏡下對比(400×)。

圖5 成脂肪誘導(dǎo)分化

2.5 成軟骨誘導(dǎo)分化 經(jīng)過21 d成軟骨誘導(dǎo)后，實(shí)驗(yàn)組被染成深紅色，說明有軟骨形成，而對照組被染成淺紅色(圖6)。

成軟骨誘導(dǎo)后，實(shí)驗(yàn)組被染成深紅色，對照組被染成淺紅色(400×)。

圖6 成軟骨誘導(dǎo)分化

2.6 單克隆形成能力檢測 將獲得的細(xì)胞集簇接種于10 cm培養(yǎng)皿，培養(yǎng)12 d，肉眼可見細(xì)胞集落形成(圖7)。

圖7 獲得的細(xì)胞集簇進(jìn)行單克隆形成能力檢測

3 討論

腰椎軟骨干細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞的一種，目前獲得成體干細(xì)胞的方法主要有：①定向誘導(dǎo)胚胎干細(xì)胞分化為成體干細(xì)胞，但是誘導(dǎo)條件復(fù)雜，現(xiàn)已很少采用。②根據(jù)干細(xì)胞的生長特性，體外分離培養(yǎng)動物的某些部位來獲取特定的細(xì)胞。此法采用較多。目前已知干細(xì)胞具有單克隆形成能力、成骨、成脂肪及成軟骨分化的重要特性[4]。本文先利用單克隆法，將原代接種于培養(yǎng)皿中獲得細(xì)胞集落，后用三向分化能力[5]、集落的單克隆形成能力檢測，驗(yàn)證通過此法獲得細(xì)胞具有干細(xì)胞特性。當(dāng)然，本文的不足之處就是未通過免疫學(xué)方法驗(yàn)證該干細(xì)胞。但是通過部位取材、原代染色、單克隆能力檢測、三向分化誘導(dǎo)這些嚴(yán)密環(huán)節(jié)，也能證明出所獲取的為腰椎終板軟骨干細(xì)胞。

干細(xì)胞的研究為疾病的臨床治療提供了新思路，早在1743 年hunter[6]就認(rèn)為軟骨損傷不能修復(fù)，上個世紀(jì)Namba 和Meuli[7]提出軟骨的修復(fù)只發(fā)生在胚胎動物。目前成體動物缺損修復(fù)的難點(diǎn)在于難以獲取大量的前提增殖細(xì)胞。本文提供的單克隆法大大節(jié)約了獲取的經(jīng)濟(jì)成本，簡化了獲取流程，為今后進(jìn)一步研究干細(xì)胞及其臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

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