老年雄性大鼠自體移植幼年睪丸組織后血清睪酮水平及間質(zhì)細(xì)胞的變化

張國飛,吳 越,鄧 瑋,陳安龍,丁興旺,史 京

(新疆醫(yī)科大學(xué)第六附屬醫(yī)院泌尿外科,烏魯木齊 830002)

隨著人類老齡化的來臨，老年人睪酮水平也隨之降低，部分老年人因此也會出現(xiàn)睪酮缺乏綜合征(testosterone deficiency syndrome，TDS)[1-4]。還有一部分患者因睪丸外傷不能原位移植致使TDS。目前治療方法有口服和靜點(diǎn)睪酮替代治療，雖取得了較好的效果但都有相關(guān)的副反應(yīng)[5-8]。睪丸組織同種異體移植及異種異體移植已做了大量研究[9],但存在免疫排斥反應(yīng)，如果針對人類進(jìn)行此類研究又有違反倫理及法律等方面的問題[10]。大量研究證明，幼年時(shí)睪丸間質(zhì)細(xì)胞胞質(zhì)中細(xì)胞器較多，線粒體多，線粒體嵴清晰，可見大量脂滴[11],且幼年睪丸間質(zhì)細(xì)胞有增殖的能力[12]，隨著年齡的增長，睪酮合成能力下降。

如果在幼年時(shí)留存部分自體睪丸組織在老年時(shí)植入體內(nèi)增加睪丸間質(zhì)細(xì)胞來增加睪酮水平，或者幼年時(shí)睪丸外傷無法原位移植，可行自體皮下移植睪丸組織，移植后不引起免疫排斥反應(yīng)，無需應(yīng)用免疫抑制劑[13]，從而為部分TDS患者尋找到療效確切又符合法律和倫理的有效的治療方法。

本實(shí)驗(yàn)在SD大鼠幼年時(shí)留存部分自體睪丸組織，冰凍保存，在老年時(shí)腋部皮下植入幼年時(shí)留存的部分自體睪丸組織，通過血清睪酮水平的測定，探討睪丸組織自體移植對睪酮的影響。因幼年時(shí)睪丸外傷后無法原位移植，冰凍留存睪丸組織，在老年時(shí)自體移植睪丸組織，從而為部分TDS患者尋找治療方法。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動物本實(shí)驗(yàn)選取雄性1月齡SD大鼠20只，體重在80～121 g，平均(104±11.3)g。實(shí)驗(yàn)動物來自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，使用許可證號：SYXK(新)2016-0002，生產(chǎn)許可證號:SCXK(新)2016-0003，本實(shí)驗(yàn)通過新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審核。用5%苦味酸溶液(黃)和0.5%中性品紅溶液(紅)標(biāo)號，每個大鼠均行標(biāo)號1～20號,每5只1籠，標(biāo)識不清楚時(shí)可補(bǔ)色。養(yǎng)到實(shí)驗(yàn)結(jié)束。

1.2試劑及實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1檢測1月齡幼年大鼠睪酮并一側(cè)睪丸切除提取睪丸組織 取20只1月齡幼年SD大鼠，行麻醉后先行眼球外側(cè)取血,測睪酮水平，行手術(shù)切除右側(cè)睪丸，提取睪丸組織并行-80 ℃冰箱冰凍保存。具體如下：3%戊巴比妥20 mg/kg腹腔注射麻醉后，大鼠仰臥固定。眼部外側(cè)插虹吸管取血，3 500 r/min離心15 min，吸取上層血清，行德國羅氏E601化學(xué)發(fā)光法試劑盒檢測血清性激素水平。均行陰囊右側(cè)切口進(jìn)入，切開陰囊，切開白膜，暴露右側(cè)睪丸。游離取出右側(cè)睪丸，分離睪丸組織，睪丸組織用DMEM(dulbecco’s modified eagle medium)培養(yǎng)基加入二甲基亞砜配制冷凍保存液，最終放入-80℃超低溫冰箱中保存起來，切口行止血縫合。

1.2.2檢測4月齡切除一側(cè)睪丸組織后成年SD大鼠血清睪酮水平 用3%戊巴比妥20 mg/kg腹腔注射麻醉后眼球外側(cè)取血，同樣方法離心及檢測血清睪酮水平。

1.2.3檢測24月齡切除一側(cè)睪丸組織后SD大鼠血清睪酮水平并行自體幼年冰凍睪丸組織皮下移植 SD大鼠至24月齡時(shí)行相同方法檢測睪酮水平，然后行自體幼年冰凍睪丸組織皮下移植，具體方法為：大鼠24月齡后(即睪丸組織冷凍23月后)，麻醉生效后行右側(cè)腋下切開0.5 cm切口，將凍存的睪丸組織迅速放入37 ℃水浴中不斷搖動，使其在1 min之內(nèi)解凍，迅速進(jìn)行腋下切口下組織移植。然后縫合腋下皮膚。

1.2.4檢測25及26月老齡SD大鼠血清睪酮水平 用3%戊巴比妥20 mg/kg腹腔注射麻醉后眼球外側(cè)取血，同樣方法離心及檢測血清睪酮水平。

1.2.5檢測睪丸間質(zhì)細(xì)胞情況 取移植前冰凍睪丸組織行10%甲醛溶液固定，24 h后將固定組織放入包埋框中做好標(biāo)記進(jìn)行脫水及石蠟包埋。制成5 μm切片，然后行HE染色。最后行高倍顯微鏡下觀察睪丸間質(zhì)細(xì)胞情況。同樣方法制作切片觀察移植后1月及2月睪丸間質(zhì)細(xì)胞情況。

2 結(jié) 果

20只大鼠中，5號大鼠在1月齡時(shí)一側(cè)睪丸組織切除后3 d死亡，11號大鼠在24月后自體移植睪丸組織后5 d死亡。1月齡SD大鼠血清睪酮水平為(0.067 0±0.031 81) ng/mL；切除一側(cè)睪丸組織4月齡SD大鼠睪酮水平為(2.695 0±0.293 18) ng/mL；切除一側(cè)睪丸組織24月齡SD大鼠睪酮水平為(1.584 2±0.43119)ng/mL；切除一側(cè)睪丸組織自體睪丸組織移植后25月齡SD大鼠血清睪酮水為(1.789 5±0.298 99)ng/mL；切除一側(cè)睪丸組織并自體移植后26月齡SD大鼠血清睪酮水為(1.516 8±0.413 82)ng/mL。各組樣本方差齊性檢驗(yàn)均為正態(tài)分布,相關(guān)干預(yù)后各月齡段SD大鼠睪酮水平兩兩比較如表1所示。

冰凍睪丸組織移植前睪丸間質(zhì)細(xì)胞情況，移植后1月及2月睪丸間質(zhì)細(xì)胞情況(如圖1)：冰凍睪丸組織移植前睪丸間質(zhì)細(xì)胞較多，移植后1月睪丸間質(zhì)細(xì)胞有減少趨勢，在2月后睪丸間質(zhì)細(xì)胞絕大多數(shù)凋亡。

表1相關(guān)干預(yù)后各月齡段SD大鼠睪酮水平兩兩比較

相比較的月齡段均值差(I?J)標(biāo)準(zhǔn)誤顯著性95%置信區(qū)間下限上限1月4月-2．62800?0．102970．000-2．8324-2．423624月-1．51715?0．102970．000-1．7216-1．312725月-1．72250?0．102970．000-1．9269-1．518126月-1．44984?0．104310．000-1．6570-1．24274月1月2．62800?0．102970．0002．42362．832424月1．11085?0．102970．0000．90641．315325月0．90550?0．102970．0000．70111．109926月1．17816?0．104310．0000．97101．385324月1月1．51715?0．102970．0001．31271．72164月-1．11085?0．102970．000-1．3153-0．906425月-0．20535?0．102970．049-0．4098-0．000926月0．067310．104310．520-0．13980．274425月1月1．72250?0．102970．0001．51811．92694月-0．90550?0．102970．000-1．1099-0．701124月0．20535?0．102970．0490．00090．409826月0．27266?0．104310．0100．06550．479826月1月1．44984?0．104310．0001．24271．65704月-1．17816?0．104310．000-1．3853-0．971024月-0．067310．104310．520-0．27440．139825月-0．27266?0．104310．010-0．4798-0．0655

*均值差的顯著性水平為0.05。

圖2 睪丸組織移植前后睪丸間質(zhì)細(xì)胞變化情況(HE，×200)

3 討 論

理論上，提高睪酮水平的方法有提高垂體功能及提高睪丸功能均可改善睪酮的產(chǎn)生。艾灸、電針、運(yùn)動等可能刺激腦部垂體釋放促性腺激素從而提高睪酮水平[14-15]，口服和靜脈點(diǎn)滴睪酮激素是治療TDS的有效方法。目前大量證據(jù)表明，TDS患者口服雄激素藥物可以獲得多種益處，包括情緒、精力狀態(tài)、幸福感、性功能、肌肉量和肌力、貧血、骨密度、認(rèn)知功能以及某些心血管危險(xiǎn)因素的改善等，而且這種獲益在老年和年輕患者中無顯著性差異[16-17]。但是可能也存在如下缺點(diǎn)[18]：①患者依從性差不能按時(shí)使用藥物；②激素補(bǔ)充使體內(nèi)24 h雄激素濃度不均衡，不能有效模擬生理濃度，從而抑制下丘腦-垂體-睪丸性腺軸的功能，可能使垂體功能及睪丸功能減弱。垂體功能減弱又進(jìn)一步減弱垂體相關(guān)激素，從而影響其他系統(tǒng)的正常功能；③誘發(fā)心臟意外；④紅細(xì)胞增多癥；⑤睡眠呼吸暫停；⑥藥物治療需要長期服用費(fèi)用昂貴。

老年雄性SD大鼠自體移植幼年時(shí)睪丸組織后血清睪酮水平在1月內(nèi)睪酮水平稍有增長，但隨著時(shí)間的推移，睪酮水平進(jìn)行性下降，我們分析有如下可能原因：①睪酮移植部位血供較差，使睪丸生精功能及釋放睪酮能力下降[19]； ②睪丸移植部位溫度較高，不能有效模擬陰囊部位的生長環(huán)境，使睪丸生精功能及釋放睪酮能力下降；③腋下自體移植睪丸組織可能會排異反應(yīng)；④睪丸組織種植到腋下脂肪層創(chuàng)面上，本身會產(chǎn)生疤痕修復(fù)及炎細(xì)胞聚集，也會使吞噬細(xì)胞吞噬睪丸間質(zhì)細(xì)胞，使睪丸組織釋放睪酮能力下降；⑤老年雄性大鼠垂體功能下降致使促性腺激素下降進(jìn)一步使睪丸功能下降；⑥大鼠自體移植幼年時(shí)冰凍睪丸組織可能也有一定的免疫排斥反應(yīng)使睪丸間質(zhì)細(xì)胞增殖受限。⑦睪丸組織用DMEM培養(yǎng)基加入二甲基亞砜配制冷凍保存液，最終放入-80℃低溫冰箱中保存起來不能有效保證睪丸組織的活性?？偨Y(jié)改進(jìn)方法：①今后能否行睪丸組織移植在陰囊內(nèi)，模擬睪丸生長的原始環(huán)境；②能否把睪丸組織移植到肌層血供豐富區(qū)，使睪丸組織得到充足的營養(yǎng)，增加睪丸組織的活性；③能否行注射器大針頭注射睪丸組織，使移植部位創(chuàng)傷較小，以免疤痕細(xì)胞集聚較多影響睪丸組織釋放睪酮；④今后能否選擇更好的保存液及液氮保存使在更低的溫度保存。

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