結直腸相關癌前病變動物模型的研究進展

張華月 李琦 付曉伶

[摘要] 結直腸癌是全球最常見的惡性腫瘤之一，畸形腺窩灶、腺瘤樣息肉均被認為是結直腸癌重要的癌前病變。本文主要從化學誘導及基因工程兩大方面綜述了結直腸相關癌前病變的動物模型的造模方法，其中化學誘導法介紹了不同病理類別動物模型的構建方法，包括結直腸炎相關癌變模型、經典畸形腺窩灶癌前病變模型、β-鏈接素蓄積腺窩灶癌前病變模型及散發(fā)性結直腸腺瘤息肉模型；基因工程技術主要從基因突變、基因敲除及相關技術等方面進行論述，并針對每種造模方法的特點及應用方面做了詳細闡述，旨在為研究結直腸癌前病變的動物造模提供依據。

[關鍵詞] 畸形腺窩灶；化學誘導法；基因工程法；癌前病變；腺瘤性息肉；動物模型

[中圖分類號] R735.34 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210（2018）02（b）-0027-06

[Abstract] Colorectal cancer is one of the most common malignancies in the world， and aberrant crypt foci and adenomatous polyps are considered to be the most important precancerous lesions of colorectal cancer. This paper mainly describes the rectum related animal model method of precancerous lesions from two aspects： chemical induction and genetic engineering. The chemical induction method will introduce the method of establishing different models of categories， including colorectal inflammatory bowel disease related cancer model， classic aberrant crypt foci precancerous lesions， β-catenin-accumulated crypt precancerous model and sporadic colorectal adenomas polyps， while genetic engineering technology mainly argues from the gene mutation， gene knock out and related technology， and describes characteristics and applications of each building method in details， aiming at providing evidences for the research of animal models of colorectal cancer lesion.

[Key words] Aberrant crypt foci； Chemical induction method； Genetic engineering method； Precancerous lesion； Adenomatous polyp； Animal model

結直腸癌多是由“正常黏膜-畸形腺窩灶（aberrant crypt foci，ACF）-腺瘤-腺癌”途徑發(fā)展而來[1]，是多步驟、多基因改變的過程。該發(fā)病途徑中涉及“ACF”和“腺瘤”兩個重要的癌前病變環(huán)節(jié)。其中ACF指一個或多個聚集成簇的形態(tài)異常的隱窩形成的病灶；結直腸腺瘤是以消化道多發(fā)腺瘤性息肉為特征的常染色體顯性遺傳病，包括家族性腺瘤性息肉?。╢amilial adenomatous polyposis，FAP）和散發(fā)性腺瘤病，主要與抑癌基因腺瘤性息肉病（adenomatous polyposis coligene，Apc）基因突變有關，有研究顯示目前我國FAP發(fā)病率為1/1700～1/5000，且有明顯的增加趨勢；散發(fā)性腺瘤與遺傳因素無關，是大腸上皮細胞增生形成散在的真性腫瘤[2]。已有研究報道，腺瘤體積與癌變率成正比，多發(fā)較單發(fā)腺瘤的癌變系數更高[3]。結直腸癌的確切病因和發(fā)病機制至今仍未闡明，也缺乏特異性有效治療藥物[4]。因此建立理想的、模擬人類結直腸癌前病變的動物模型對研究該病機制和開發(fā)臨床治療藥物具有重要的意義?，F將近年來國內外研究中提出的結直腸癌前病變模型做一系統(tǒng)論述，并對其特點加以評述。

1 化學誘導癌前病變模型

化學誘導法包括單藥誘導法和復合藥物誘導法。由于化學誘導劑的劑量、給藥途徑、誘導期、動物品系等因素的不同，其建立的結直腸相關癌前病變的動物模型種類也較豐富，比如自發(fā)性腸癌變動物模型、炎癥性腸癌變動物模型等。

1.1 結直腸炎相關癌變模型構建

通過葡聚糖硫酸鈉（DSS）、二甲肼（1，2-dimethylhydrazine，DMH）、氧化偶氮甲烷（AOM）等化學誘導復合法可制備潰瘍型結直腸炎癌變（ulcerative colitis associatedcarcinogenesis，UCAC）模型。目前有4種造模方法，第1種為單藥DSS誘導法，予5%DSS連續(xù)飲用5 d，出現體重下降、排便增多、便溏甚至血便等急性腸炎癥狀，該造模方法簡單易操作，但癌變率不高，不建議用于癌變造模。第2種為AOM與DSS聯合誘導法，予第1天腹腔注射AOM（12.5 mg/kg），第6天起連續(xù)5 d飲用2.5%DSS水，三周三循環(huán)。4周出現急性黏膜炎和ACF，7周出現腺瘤中-重度不典型增生改變，14周出現腺癌。該造模方法較好地模擬人類腸炎向腸癌進展過程。第3種為DMH與DSS聯合誘導法，予腹腔注射DMH（20 mg/kg），1周2次；繼而3%DSS，連續(xù)飲用2周，三周三循環(huán)法，20周出現稀便、腹瀉、大便隱血（+）和肉眼血便中的任一癥狀[5-6]。鏡下見黏膜息肉樣隆起，高級別上皮內瘤變、部分見癌變。該造模方法可較好地觀察炎癥向癌逐漸轉化的過程，但造模時間和實驗周期較長。另有研究證實高脂飲食是癌前病變中潰瘍型結直腸炎及其不典型增生的重要致病因素[7]。高脂飲食聯合AOM/DSS誘導法更符合臨床脂代謝異常與腸息肉發(fā)病的密切相關性。以飲用3%DSS水3 d+滅菌水4 d為1個循環(huán)周期，重復9個周期。前3個循環(huán)周期的每周第1天，腹腔注射AOM（10 mg/kg）。高脂飼料和DSS同步干預。第9個周期所有小鼠均出現腹瀉、稀便，部分小鼠有肉眼血便。該模型造模周期短，說明高脂飲食可以加重AOM/DSS誘導的小鼠UC及其不典型增生。

因此成功建模要綜合考慮動物種屬、周齡、AOM及DSS濃度、分子量及暴露時間。這可能與腸道菌群失調、巨噬細胞功能障礙、負電荷影響腸上皮合成、抑制上皮細胞增生、破壞腸黏膜屏障等因素有關。AOM/DSS化療誘導復合法造模具有致癌方法簡單、成瘤率高、周期短、可重復性強的特點，由于此造模方法能很好地模擬慢性腸道炎癥誘發(fā)癌癥的生理病理過程，故而近年來被廣泛用于炎癥相關性癌癥形成機制的研究[8]，但病變主要為化學損傷所誘導的慢性炎癥性癌變，故無法模擬其他因素的自發(fā)性慢性癌變，因而稍顯不足。

1.2 經典ACF癌前病變模型

AOM、DMH、4-氨基聯苯（4-aminobipheny1）、N-亞硝基-N-正-甲基尿素（N-nitroso-N-methylurea）和3-甲基蒽膽（3-methylcholanthrene）等遺傳毒性致癌物均能通過使DNA堿基甲基化，誘導生成ACF，誘發(fā)結腸黏膜腫瘤形成。ACF是最小最早期的大腸黏膜病變，是嚙齒類動物和人結直腸癌發(fā)展過程中最早階段的顯微損傷，是評價結直腸腫瘤藥物療效的良好生物學標志。魏華等[9]及邱云平等[10]采用單藥DMH化學誘導法，于雄性Wistar大鼠頸背部皮下注射DMH（30 mg/kg），1次/周，注射2周，9周造模成功；或者DMH（20 mg/kg），1次/周，注射10周，16周造模成功。陳立勇[11]應用單藥AOM誘導法從實驗第2周開始對雄性Wistar大鼠腹腔注射AOM（15 mg/kg、1.25 g/L），1次/周，連續(xù)2周，13周造模成功。大鼠結腸內發(fā)現大量ACF，且PCNA-L1和AgNORs顯著升高，提示該腸組織細胞有顯著的增殖活性。布圖雅等[12-13]應用AOM/DSS法對雄性Balb/c小鼠給予腹腔注射AOM（10 mg/kg，1 g/L）1次，繼而飲用3%DSS溶液1周，三周三循環(huán)法，造模9周，20周后可見小鼠體重減輕，倦怠拱背，有黏液血便，并出現脫肛；肉眼觀察小鼠結腸，以散在、多發(fā)性息肉狀隆起性病變?yōu)橹?，HE染色見異常隱窩呈不規(guī)則分支。ACF大量出現，大小不等，核分裂多、排列擁擠到腸腺腔面，NF-κB、COX-2含量顯著升高。

AOM與DMH單藥化學誘導法造模時間均較短，而AOM/DSS聯合誘導法建模時間過長，其檢測方法雖較簡便，但模型判斷主觀性強，病理分析困難，仍缺乏組織學證據，ACF是腸癌發(fā)病過程的中間重要環(huán)節(jié)，同時ACF模型怎樣發(fā)展為腺瘤，能否替代結腸癌模型甚至人類結腸癌用于一些科學研究尚存爭議。

1.3 BCAC癌前病變模型構建

日本學者Yamada等[14-16]對近交系F344大鼠注射DMH建立BCAC動物模型，首次提出β-鏈接素蓄積腺窩灶（β-catenin-accumulated crypt，BCAC）是AOM誘導F344大鼠模型中一種與結直腸癌關系比經典ACF更為密切的癌前病變，其進展成腺瘤和腺癌的潛在危險性更高。Yamada等[17]和Kuno等[18]實驗提示，BCAC在腸黏膜中的分布密度及復雜性更明顯，故BCAC在形態(tài)學觀察、分子病理學研究、細胞增殖凋亡、預防結腸癌形成、篩選抗腫瘤藥等方面顯示出更大的優(yōu)勢。但目前的研究還不夠深入，可重復性不強，且迄今還未在人的腸黏膜證實有相同的病變，其特征有待進一步明確。

1.4 散發(fā)性結直腸腺瘤息肉模型構建

目前常用SD品系、F344大鼠做造模動物，誘導癌變發(fā)生率高，解剖結構更易辨認，且較接近結直腸息肉自然發(fā)生、發(fā)展過程。王偉杰等[19]對雄性SD品系大鼠皮下注射DMH（20 mg/kg），每周1次，持續(xù)18、20周時誘導出增生性息肉和腺瘤性息肉，此方法操作簡單，造模周期短，成息肉率高，更貼切模擬人結直腸息肉自然生長的過程，為開展人結直腸息肉的研究提供一種理想的動物模型。另有Watanabe等[20]曾于1987年采用直腸內注射N-甲基亞硝基脲（MNU）方法誘導F344大鼠造模成功，于30～40周出現多發(fā)性腫瘤。該造模方法癌變發(fā)生率高，但造模耗時長，較少使用。單純高劑量致癌劑-癌前病變模型組（AOM組），第1天開始給予腹腔注射AOM（10 mg/kg），每周1次，7周時可見到ACF灶，14周見腺瘤樣突起，灶性中-重度不典型增生。綜上，我們業(yè)已用MNU、DMH、AOM誘導F344大鼠結直腸的癌前病變。單藥DMH法及MNU法的成癌性高，但造模時間長。AOM誘導F344大鼠造模方法最短，簡單易重復，但該方法還需進一步實驗證實。

張耀朋等[21]對雄性SD大鼠采用DMH和PPAR-γ受體拮抗劑GW9662（促瘤劑）誘發(fā)結直腸散發(fā)性腺瘤模型。首劑量為腹腔注射DMH（120 mg/kg），2周后皮下注射20 mg/kg加強1次；2周后予GW9662，首劑量靜脈注射0.3 mg/kg，后靜脈注射0.1 mg/（kg·周）；12周造模成功，DMH+GW9662組發(fā)現腺瘤平均大小1.3 mm。腺瘤誘導成功率為87.5%，該方法成功率高，誘導時間短，腺瘤荷瘤率較高，組織量多且評價客觀，較單純DMH誘導的大鼠結腸癌息肉模型更具實用價值。與傳統(tǒng)的結直腸炎癌前病變模型和ACF模型相比，具有經濟、實用、高效、穩(wěn)定的優(yōu)點，可以彌補兩個傳統(tǒng)模型的不足。但該模型涉及GW9662目前僅應用于體外的細胞學研究，其在體內的研究很少，藥代動力學特點尚待闡明，仍需深入研究。

2 基因工程動物模型

迄今為止，與腸道腫瘤相關的基因突變小鼠或基因敲出小鼠等基因工程小鼠的種類已有30多種[22]。目前基因工程小鼠模型有轉基因Apc（Min/+）變小鼠、雙基因缺陷ApcMin/+雜合小鼠、基因敲除小鼠如ApcΔ14/+基因小鼠、ApcΔ716/+基因敲除小鼠、PTEN腸息肉小鼠以及BMP息肉小鼠模型等。

2.1 轉基因Apc（Min/+）突變小鼠模型的構建

目前轉基因ApcMin/+突變小鼠是國際公認的家族腺瘤性息肉病和散發(fā)性大腸癌癌前病變的動物模型，具有可遺傳性、自發(fā)性和穩(wěn)定性的特點[23-24]。葉志金等[24]研究發(fā)現ApcMin/+小鼠9周齡時發(fā)生腸道腺瘤，從9～24周齡，腺瘤體積持續(xù)增大，但小腸腺瘤數目不再增加，15周以后腺瘤快速生長，24周時由于腺瘤體積過大及其對營養(yǎng)的消耗而導致貧血，從而致多數小鼠死亡。Yamada等[25]研究發(fā)現，成年小鼠小腸中肉眼可見的瘤體數量明顯多于結直腸，結直腸中瘤體組織為腺瘤或腺癌，并在其腸黏膜中發(fā)現有異常隱窩。鏡下結直腸中的病變損及面積明顯小于小腸，但結直腸病變的發(fā)生率卻明顯高于小腸病變。此外有研究發(fā)現，在DSS誘導下的Min小鼠要比未做任何處理的Min小鼠在生成腫瘤數量和形成上更顯著；也有研究證實，EphB表達下降可以加速Min小鼠腸道腫瘤發(fā)生；另有研究發(fā)現Min小鼠中Mom1、Mom2、Mom7是可調節(jié)腫瘤數量的遺傳位點，其中Mom2基因位點可抑制腸道腫瘤發(fā)生。ApcMin/+小鼠常發(fā)生小腸腫瘤，與人類常見的結直腸腫瘤尚存在一定差異，且因小腸較長的生理特征使其不利于實驗研究；另一方面有研究提示ApcMin/+小鼠腸道息肉一般是良性的，不具有侵襲性，僅有極少數會發(fā)展為侵襲性的腺癌，這與FAP最終進展為侵襲性的結直腸腺癌不一致。其次大多數Min模型小鼠的生存期均少于120 d，且常伴有慢性貧血的癥狀[26]。目前，已陸續(xù)有研究人員制備出和Apc基因高頻突變位點有關的突變小鼠，如APC基因突變系小鼠Δ14、Δ716、Δ1309和1638N等已廣泛被應用。

2.2 單基因敲除小鼠模型

單基因缺陷小鼠靶點單一且明確，能為臨床藥物的機制研究提供重要實驗依據，已陸續(xù)有研究人員制備出一系列基因敲除小鼠（knockout mice），如p53基因敲除小鼠、IL-10基因敲除小鼠、Gαi2基因敲除小鼠、APCloxP等位基因特異性敲出小鼠等眾多基因敲出小鼠模型[27]。眾多基因敲出小鼠模型中，ApcΔ716/+基因敲除小鼠較ApcMin/+小鼠模型可生成更多的小腸微小息肉；在對APC△1309小鼠模型研究中，Niho等[28]研究發(fā)現處于高脂血癥狀態(tài)下的APC基因突變小鼠可以抑制小腸腺瘤的形成。

周素麗等[29]研究發(fā)現MSH2基因缺失的小鼠會致使抑癌基因失活，相較而言，其腸道腺瘤的發(fā)生率較正常小鼠顯著升高；廖超男等[30]利用Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)，在腸道絨毛和隱窩上皮細胞條件性敲除APC基因，并將VillinCre小鼠和APCfl/fl小鼠雜交得到VillinCre；APCfl/+小鼠，其后進一步與APCfl/fl小鼠雜交，得到VillinCre；APCfl/fl小鼠，將其解剖發(fā)現其自發(fā)產生腸道腫瘤，免疫組化顯示激活Wnt信號通路，成功地構建了小鼠腸道條件性敲除APC基因腺瘤模型。Cre-LoxP重組酶系統(tǒng)是條件性基因打靶、誘導性基因打靶、時空特異性基因打靶策略的技術核心，現已在新型基因打靶中獲得廣泛應用[31]。

2.3 雙基因缺陷ApcMin/+雜交小鼠模型

雙基因缺陷ApcMin/+小鼠指ApcMin/+小鼠與某種基因缺陷的小鼠進行交配，得到子代小鼠，通過對基因型的鑒定，篩選出具有APC基因突變及另一種基因突變的雙基因突變子鼠。近年來，基于ApcMin/+小鼠模型所建立起來的雙基因突變的小鼠模型已有一百多種，主要用于研究某一基因對ApcMin/+小鼠腸道腫瘤發(fā)生和發(fā)展的影響及相關的機制。胡曦文等[33]用ApcMin/+雄性小鼠與p110δD910A/D910A雌性小鼠雜交成功構建ApcMin/+；p110δD910A/D910A小鼠模型并得以穩(wěn)定傳代，并確認腸道腫瘤的初步表型。時洪凱等[34]建立子代BubR1+/-ApcMin/+復合突變小鼠模型。該模型成瘤時間短，成瘤率較高且腫瘤組織的病例和生物學特征穩(wěn)定，能較好地模擬人類結直腸腫瘤自然生長的過程。ApcΔ716/+小鼠是家族性腺瘤性息肉病模型鼠，Aoki等[35]將ApcΔ716敲除小鼠和Cdx2+/-突變小鼠進行雜交，子代ApcΔ716Cdx2+/-小鼠結直腸息肉的發(fā)生率及數量顯著增加，但是目前其機制尚不清楚。沈曉東[36]將其與Id2敲除的基因工程小鼠雜交，獲得ApcΔ716/+Id2-/-雜交小鼠，實驗證實Id2的缺失能抑制ApcΔ716/+小鼠腸道腫瘤的發(fā)生，推斷Id2基因在人類腸道腫瘤中可能發(fā)揮著促進腫瘤形成的作用。

2.4 BMP息肉小鼠模型構建

BMP息肉小鼠是指采用跨胎盤RNAi技術沉默siBMP4構建的小鼠腸道息肉模型。向麗[37]采用跨胎盤RNAi技術，在孕鼠的尾靜脈注射沉默BMP4基因的質粒，通過跨胎盤RNAi干擾子一代小鼠的BMP4的表達構建模型小鼠。BMP息肉小鼠模型第8周經HE染色見腺體上皮增生，病理顯示息肉生成，第10周腫塊明顯增多，但未見腺癌樣改變。實驗通過跨胎盤RNAi技術首次成功構建了BMP息肉小鼠模型，證實了BMP參與結直腸息肉的形成，為更深入地研究結直腸息肉發(fā)生、發(fā)展及惡變的機制探尋了一種新的方法，此技術方法還有待進一步的完善并推廣。

2.5 運用CRISPR 技術構造小鼠模型

CRISPR技術是新一代的基因組編輯工具，能夠剪斷DNA分子，完成以RNA為導向的DNA識別及編輯，并對靶基因進行刪除、添加、激活或抑制等各種改造。Drost等[39]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術靶向下調了結直腸癌細胞中結直腸細胞家族性腺瘤樣結腸息肉?。╝denomatous polyposis coli，APC）易感基因、抑癌基因p53和DPC4，并導入K-Ras基因。此技術對構建結直腸癌前病變模型也提供了研究的新方法新思路。但是仍存在一些問題，CRISPR/Cas9系統(tǒng)可同時切割基因組中相同或高度相似的DNA同源序列，導致非靶點突變即脫靶效應[40-42]。

綜上所述，一個成功的結直腸相關癌前病變動物模型是可以從發(fā)病機制、組織病理學、臨床表現等多方面模擬出與人類相似的腸腺瘤性息肉的特征。國內外對腸相關癌前病變動物模型的鑒定主要依靠PCNA-L1和AgNORs等細胞增殖活性的檢測及ACF等組織病理學檢測等方面。目前，構建結直腸息肉模型有多種方法，如動物自發(fā)結直腸癌癌前病變模型、致癌因素誘發(fā)動物模型、遺傳工程動物模型、小鼠自發(fā)的移植瘤模型和人源腫瘤細胞移植瘤模型，但一般情況下多從化學藥物誘導及基因工程兩大方向著手，其中化學誘導法中的AOM/DSS復合化學法誘發(fā)癌前病變是目前較常用的動物模型，病變主要發(fā)生在結腸，能較好地模擬人類慢性腸道炎癥誘發(fā)癌癥的生理病理過程，是研究炎癥相關性癌癥和藥物篩選的理想動物模型?；蚬こ绦∈竽Ｐ椭械腁PCMin/+小鼠是國際公認的家族腺瘤性息肉?。‵AP）和散發(fā)性大腸癌癌前病變的動物模型，具有可遺傳性、自發(fā)性和穩(wěn)定性的特點，但極少會發(fā)展為侵襲性的腺癌，這與人類的家族性結腸腺瘤息肉最終進展為侵襲性的結直腸腺癌結局不一致。另外與結直腸相關的癌前病變如ACF和BCAC等臨床特征，還需更加客觀可靠的鑒定方法。今后動物模型的鑒定仍需從多方面進行評估，不僅僅要模仿人類癌前病變的某單一方面特征。我們期待建立更理想的結直腸癌癌前病變動物模型，以便更好地指導我們從不同角度探討人類腸道相關癌前病變的病因、發(fā)病機制及治療藥物的療效等研究。

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