青貯玉米中10種霉菌毒素LC-MS/MS檢測方法的建立和應(yīng)用

■ 張養(yǎng)東 楊軍香 宋孝明 石慧麗 王宗偉 鄭 楠 李松勵 王加啟

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，農(nóng)業(yè)部奶產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險評估實驗室（北京），北京 100193；2.農(nóng)業(yè)部奶及奶制品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（北京），北京 100193；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，動物營養(yǎng)學(xué)國家重點實驗室，北京 100193；4.全國畜牧總站,北京 100125；5.山東省壽光市畜牧獸醫(yī)管理局，山東壽光 262700）

霉菌毒素（mycotoxin）普遍存在于青貯玉米飼料中，霉菌毒素能夠影響青貯玉米中的營養(yǎng)成分含量及其吸收代謝，降低奶牛采食量和產(chǎn)奶量，抑制奶牛的免疫功能等。如果飼料中含有大量霉菌毒素，奶牛所產(chǎn)的牛奶中霉菌毒素可能超標(biāo)，人類短期或長期飲用此類牛奶后，會導(dǎo)致疾病或癌癥。例如，人們食用含有黃曲霉毒素M1（AFM1，AFB1羥基化）牛奶及其制品后，容易引起肝臟損傷、肝硬化、腫瘤誘導(dǎo)和致突變及免疫抑制等負(fù)面作用；黃曲霉毒素能夠影響母鼠胎盤的功能，使母鼠的分娩時間提前，小鼠出生重減輕，并容易導(dǎo)致母鼠早產(chǎn)（Wang等，2016）。Alonso等（2013）報道，霉菌污染不僅會造成動物疾病、經(jīng)濟(jì)損失，還會影響人類健康，尤其是嬰兒健康。2013年度至2015年度對全國1 080個反芻動物養(yǎng)殖點調(diào)研發(fā)現(xiàn)，反芻動物可見霉菌污染的飼料種類中，青貯玉米是主要的飼料種類。因此，了解和控制青貯飼料中霉菌毒素污染狀況，對保證反芻動物食品安全具有重要的意義。

本試驗根據(jù)青貯玉米飼料的特性，以及10種霉菌毒素的結(jié)構(gòu)特征，改進(jìn)已有測定豬消化液中霉菌毒素的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）方法（王瑞國等，2015），建立適用于青貯玉米中10種霉菌毒素檢測的LC-MS/MS方法，并使用該方法測定2015年度10個奶牛場的14個全株青貯玉米樣品中的霉菌毒素（AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、麥角醇、雜色曲霉毒素、HT-2毒素和T-2毒素）含量，以更深入的了解青貯玉米飼料中的霉菌毒素污染情況。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 儀器

液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters Acquily UPLC Xevo TQS），高速冷凍離心機(jī)（HITACHI GR22GIII），旋渦振蕩儀（Scientific Industries Voter Gnie 2），Mycospin 400多功能凈化柱（Romer公司）。

1.1.2 試劑

本試驗所用乙腈（Fisher Scientific公司）為色譜純，AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、麥角醇、雜色曲霉毒素、HT-2毒素和T-2毒素標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma公司）。其他試劑均為分析純。

1.2 試樣制備和色譜條件

1.2.1 制備青貯玉米提取液

稱取(1.00±0.01)g試樣于50 ml塑料離心管中，加入8 ml乙腈-水-甲酸（84∶15.9∶0.1，V/V）進(jìn)行提取，渦旋混勻1 min，搖床劇烈振蕩20 min。提取完成后，以1 000 r/min離心10 min,取1 ml上清液于Mycospin 400多功能凈化柱中，收集濾液，放入自動進(jìn)樣瓶中，直接上高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（HPLC/MS/MS）儀器測定。

1.2.2 制備AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、DON、ZEN、麥角醇、雜色曲霉毒素、HT-2毒素和T-2毒素儲備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液

1 mg/ml各霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)儲備液：稱取10 mg各霉菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品分別溶于10 ml乙腈中。10 mg/l的中間混合標(biāo)準(zhǔn)溶液：吸取100 μl各儲備液于10 ml容量瓶中，用乙腈定容混勻。工作液用乙腈∶水（50∶50，V/V）稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制。儲備液和中間標(biāo)準(zhǔn)混合液在-20℃下冷凍保存，工作液在4℃保存。

1.2.3 色譜和質(zhì)譜條件

液相條件：色譜柱：ACQUITY UPLC HSS T3 Column,2.1×100 mm,1.8 μm；溫度：40 ℃；進(jìn)樣體積：5 μl；流速：0.35 ml/min；流動相A：0.1%甲酸乙腈溶液；流動相B：0.1%甲酸水溶液（見表1）。

表1 流動相梯度

MS條件：多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）ESI+；離子源溫度：150℃脫溶劑氣：氮氣；霧化溫度400℃；毛細(xì)管電壓：3.00 kV；碰撞氣：氬氣，流速0.16 ml/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 提取過程優(yōu)化

青貯玉米質(zhì)地輕、密度低、吸水性比較強(qiáng)，相對于王瑞國等（2015）的報道，添加提取液重量體積比由1∶1增加到1∶4，然后直接用提取溶液上機(jī)。

2.2 色譜條件優(yōu)化

提取溶液中有機(jī)相比例較高，用BEH C18的色譜柱DON的溶劑效應(yīng)較明顯，峰形顯著低于HSS T3色譜柱（見圖1）。

圖1 BEH C18色譜柱與HSS T3色譜柱峰形

2.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

以乙腈-水（50∶50，V/V）為流動相，采用結(jié)合（Combine）進(jìn)樣方式，對10種霉菌毒素的質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化，在正、負(fù)離子模式下進(jìn)行全掃描，選擇合適的準(zhǔn)分子離子峰和電離方式。盡管OTA和DON在負(fù)電離模式下也有較好的響應(yīng)，考慮到提取液和流動相中都有甲酸，甲酸有利于正電離的模式下物質(zhì)的離子化，并且在一次進(jìn)樣檢測中，不用通過正負(fù)離子模式的切換，這樣在大批量樣品檢測過程可減少儀器的損耗，因此10種霉菌毒素都選用了正離子模式。并結(jié)合基質(zhì)空白和基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液的離子掃描圖，進(jìn)一步優(yōu)化參數(shù)確定了各種毒素在多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）下信號采集的特征離子對及質(zhì)譜條件（見表2）。

表2 質(zhì)譜參數(shù)

2.4 方法的線性范圍與定量限

空白樣品提取液中添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照前處理過程，取1 ml經(jīng)Mycospin 400凈化的提取液，配制濃度為5～100 ng/ml的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。根據(jù)3倍信噪比（S/N）確定化合物的方法檢出限（LOD）；根據(jù)10倍信噪比（S/N）確定化合物的方法定量限（LOQ），以濃度為橫坐標(biāo)，定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)做標(biāo)準(zhǔn)曲線，10種組分在正離子模式下均呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)（r）均不低于0.998（見表3）。

表3 方法的線性范圍與定量限

2.5 回收率和精密度實驗

采用空白樣品，進(jìn)行添加回收和精密度實驗。樣品中添加低、中、高3個濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個添加濃度設(shè)6個平行，按本實驗方法進(jìn)行樣品處理和上機(jī)測定，平均回收率為67.4%～114.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.2%～6.1%（見表4）。

2.6 青貯玉米中的霉菌毒素含量

10個奶牛場14個全株玉米青貯玉米樣品檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，全部檢出的霉菌毒素種類為嘔吐毒素、黃曲霉毒素B2和玉米赤霉烯酮，河南、河北和山東還檢出麥角醇。霉菌毒素含量由高到低依次為嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B2和麥角醇（見表5），不過各霉菌毒素含量均未超出國家飼料衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中霉菌及霉菌毒素含量（GB13078-2001、2006、2007）范圍。AFB1、AFG1、AFG2、HT-2、T-2、Sterigmatocystin這6種毒素均未檢出。

奶牛飼養(yǎng)場的條件不同，造成各家奶牛場原料品質(zhì)差異極大。從本檢測結(jié)果看，各奶牛場需要重點關(guān)注嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮和黃曲霉毒素B2。其中嘔吐毒素和玉米赤霉烯酮影響奶牛健康、產(chǎn)奶性能與繁殖性能，而黃曲霉毒素則直接影響牛奶品質(zhì)問題。

3 結(jié)語

本文建立了采用乙腈-水-甲酸（84∶15.9∶0.1，V/V）提取，多功能凈化柱凈化，HPLC-MS/MS分析法同時測定青貯玉米中的黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素B2、黃曲霉毒素G1、黃曲霉毒素G2、嘔吐毒素、玉米赤霉烯酮、麥角醇、雜色霉素、HT-2毒素和T-2毒素10種真菌毒素殘留的快速檢測方法。本方法前處理步驟簡單，具有靈敏、快速的特點，分析時間小于7 min，10種霉菌毒素在線性范圍內(nèi)5～100 μg/kg，檢出限均小于1.0 μg/kg，均能滿足國家對飼料中霉菌毒素限量的要求。

表4 回收率和精密度結(jié)果

表5 奶牛場全株玉米青貯樣品中霉菌毒素含量(μg/kg)