一種快速測定粗蛋白方法的初步研究

■趙德志 傅永鋼 朱凌盈 于 菲 陳少澤

（寧波天邦股份有限公司，浙江寧波 315475）

蛋白質(zhì)是有機(jī)大分子，是由氨基酸組成的一類化合物，是構(gòu)成機(jī)體組織、體細(xì)胞的基本成分，是生命的物質(zhì)基礎(chǔ)，是生命活動的主要承擔(dān)者。蛋白質(zhì)的種類很多，性質(zhì)、功能各異，如果動物飼料日糧中蛋白質(zhì)含量較少，飼料利用率就低，機(jī)體的生長就會受限，體重下降；蛋白質(zhì)缺乏嚴(yán)重還會導(dǎo)致動物的繁殖機(jī)能紊亂等。

為了衡量動物飼料的優(yōu)劣，蛋白質(zhì)含量首當(dāng)其沖成為評價飼料營養(yǎng)品質(zhì)的直接指標(biāo)。又因?yàn)樵现写值鞍踪|(zhì)的含量與飼料中的蛋白質(zhì)含量存在線性關(guān)系，蛋白質(zhì)的含量決定飼料的品質(zhì)。為了嚴(yán)

把質(zhì)量關(guān)，原料中粗蛋白含量已成為飼料生產(chǎn)企業(yè)日常檢測工作中的必檢項(xiàng)目。到目前為止，由于沒有簡便快捷的測量方法，各大公司仍然采用傳統(tǒng)的測量方法。但是傳統(tǒng)方法在消化過程中存在消化時間長，操作過程比較繁瑣以及消化時間和消化溫度等因素影響消化率等問題，致使實(shí)驗(yàn)存在成本高昂、效率低下等嚴(yán)重缺陷。為了縮短操作時長，規(guī)避消化時間和消化溫度對實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，并從降低實(shí)驗(yàn)成本和提高實(shí)驗(yàn)效率的多重因素考慮。本實(shí)驗(yàn)選取棉粕和魚粉為樣品，以國標(biāo)法作對照，進(jìn)行相關(guān)研究，旨在簡化樣品消化過程，提高消化率，提升蛋白質(zhì)的測定效率，為飼料行業(yè)快速測定各原料中粗蛋白的含量提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 原料

棉粕、魚粉（均為寧波余姚市售）。

1.1.2 儀器

AL204-1電子天平、粉碎機(jī)、40目分樣篩、250 ml三角瓶、250 ml消化管、移液管、10 ml量筒、滴定管、半自動定氮儀。

1.1.3 試劑

濃硫酸、無水硫酸銅、硫酸鉀、氫氧化鈉（江蘇彤晟化學(xué)試劑有限公司）；硼酸、甲基紅、溴甲酚綠、乙醇、鹽酸、蔗糖、硫酸銨、酚酞試劑（國藥化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 溶液的配制

混合催化劑：稱取0.4 g無水硫酸銅和6 g硫酸鉀，研磨后混勻，備用。

氫氧化鈉溶液：準(zhǔn)確稱取40 g氫氧化鈉固體，將其加入到40 ml水中溶解，搖勻后，定容至100 ml，備用。

混合指示劑：將0.1 g甲基紅和0.5 g溴甲酚綠分別溶于100 ml無水乙醇中，搖勻后，按1∶1混勻待用。

硼酸吸收液：分別量取0.1%溴甲基綠乙醇溶液10 ml、0.1%甲基紅乙醇溶液7 ml和4%氫氧化鈉水溶液0.5 ml，將其加到1 000 ml的1%硼酸水溶液中，搖勻待用。

1.2.2 樣品的處理

將適量的棉粕和魚粉進(jìn)行粉碎后，準(zhǔn)確稱取上述樣品各5組，每組兩份。一份按GB/T6432-1994進(jìn)行處理，另一份采用過氧化氫代替國標(biāo)法中的混合催化劑，不經(jīng)過消化爐消化的快速法處理。然后，將上述兩種處理樣品進(jìn)行氨的蒸餾。

1.2.3 氨的蒸餾

首先分別向盛有上述溶液的消化管內(nèi)分別滴加2滴指示劑（對照組加入混合指示劑，實(shí)驗(yàn)組加入酚酞指示劑），并向上述消化管中加入過量的氫氧化鈉溶液；接著將其安裝在半自動定氮儀上，并將定氮儀的冷凝管末端要放入裝有25 ml硼酸吸收液的錐形瓶內(nèi)，然后進(jìn)行蒸餾。蒸餾時間以吸收液體積達(dá)到150 ml時為宜。取下錐形瓶后，用蒸餾水沖洗冷凝管末端，并將洗液倒入錐形瓶內(nèi)，最后進(jìn)行滴定。

1.2.4 滴定

分別向上述吸收液中滴加3～5滴混合指示劑，用0.1 mol/l的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液進(jìn)行酸堿中和滴定，滴定至吸收液顏色由藍(lán)綠色變成灰紅色為終點(diǎn)。記錄消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積。

1.2.5 空白對照

準(zhǔn)確稱取0.2 g蔗糖作空白對照，按GB/T6432-1994進(jìn)行消化、蒸餾和酸堿滴定等，并記錄滴定消耗的標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液的體積。

1.2.6 粗蛋白的含量計(jì)算

結(jié)合空白對照，對棉粕和魚粉中的粗蛋白含量進(jìn)行計(jì)算。計(jì)算公式為：

式中：CP——粗蛋白；

v1——滴定空白時所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積(ml)；

v2——滴定樣品時所需標(biāo)準(zhǔn)酸溶液體積(ml)；

C——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(mol/l)；

V——試樣分解液總體積(ml)；

v'——試樣分解液蒸餾用體積(ml)；

0.014 0——與1.00 ml鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量(g)；

M——試樣的質(zhì)量(g)。

1.2.7 精密度檢測

準(zhǔn)確稱取0.2 g的棉粕和魚粉粉末各3組，每組兩份，分別進(jìn)行快速法和國標(biāo)法測試粗蛋白含量，并對數(shù)據(jù)進(jìn)行誤差分析，驗(yàn)證快速法的系統(tǒng)精密度。

1.2.8 換算系數(shù)的確定

精確稱取不同質(zhì)量的棉粕和魚粉粉末各5組，每組兩份，質(zhì)量分別為0.10、0.15、0.20、0.25、0.30 g，分組利用快速法和國標(biāo)法對所含粗蛋白進(jìn)行檢測，確定快速法和國標(biāo)法之間的線性關(guān)系即換算系數(shù)。

1.2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn)

隨機(jī)選取5個不同產(chǎn)地的棉粕和魚粉樣品，粉碎后，分別進(jìn)行國標(biāo)法和快速法檢測，求出兩種方法的比值，繪制趨勢圖。驗(yàn)證快速測定方法的縱向穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.1 棉粕中粗蛋白測試結(jié)果比較

通過預(yù)試驗(yàn)得知，當(dāng)樣品中的粗蛋白含量約為80 mg時，滴定終點(diǎn)所消耗的鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液在10 ml左右。為了便于操作，滴定結(jié)果更準(zhǔn)確，本試驗(yàn)按表1稱取5組棉粕樣品，且每組兩份：一份用國標(biāo)法，另一份用快速法測定粗蛋白含量，記錄測量結(jié)果，并求出國標(biāo)法和快速法的比值及比值的RSD(%)。試驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 國標(biāo)法和快速法測定的粗蛋白含量及其比值(棉粕)

通過表1可以看出，國標(biāo)法測出的粗蛋白含量為56.65%左右，快速法測得的粗蛋白含量為33.03%以上。兩種方法的結(jié)果在數(shù)值上存在較大差距，通過計(jì)算和比較發(fā)現(xiàn)兩種結(jié)果的比值較穩(wěn)定，約為1.715，且比值的RSD僅為0.086%＜＜1%。說明快速法雖然不能直接測出樣品中的粗蛋白含量，但是存在通過快速法和比值相結(jié)合計(jì)算出粗蛋白總含量的可能。

2.2 魚粉中粗蛋白測試結(jié)果比較

為了排除棉粕結(jié)果的偶然性，本次試驗(yàn)選取粗蛋白含量與棉粕相近的魚粉為原料，隨機(jī)稱取約0.12 g的樣品5組，每組兩份：一份采用國標(biāo)法，一份采用快速法，結(jié)果如表2所示。

表2 國標(biāo)法和快速法測定的粗蛋白含量及其比值(魚粉)

通過表2可以發(fā)現(xiàn)，國標(biāo)法和快速法測出魚油中的粗蛋白含量同樣存在較大差距，且兩種方法測得的結(jié)果的比值與2.1節(jié)中的結(jié)果一致，且比值的RSD值為0.049%＜＜1%。說明通過快速法與比值相結(jié)合計(jì)算樣品中粗蛋白總含量的快速方法具有一定的可行性。

2.3 精密度檢測

為了進(jìn)一步確定該方法的可行性，此次試驗(yàn)同時選取棉粕和魚粉作樣品，并精密稱取0.200 0 g的上述樣品各3組，每組兩份，重復(fù)上述試驗(yàn)，確定方法的重現(xiàn)性和測量儀器的精密度。結(jié)果如表3所示。

表3 快速法的系統(tǒng)精密度分析

從表3中可以看出，試驗(yàn)結(jié)果與2.1和2.2的結(jié)果一致，比值RSD值僅為0.052%。說明快速法的系統(tǒng)精密度較高，且能夠利用該方法準(zhǔn)確計(jì)算出上述兩種原料中的粗蛋白含量。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

為了確定換算系數(shù)，試驗(yàn)選取不同質(zhì)量的棉粕和魚粉5組，并以快速法測定值為橫坐標(biāo)，國標(biāo)法為縱坐標(biāo)，繪制線性關(guān)系圖，結(jié)果如圖1所示。

圖1 兩種方法測得值的線性關(guān)系

從圖1中可以看出，棉粕和魚粉的五組數(shù)據(jù)的線性關(guān)系方程為：Y=1.715X-0.041，且R2=0.999 9。由R2值可以看出兩種方法的線性關(guān)系良好。通過線性方程式中X的系數(shù)可以得出兩種方法的換算系數(shù)為1.715，而且誤差僅為0.041%＜＜1%。說明快速法和國標(biāo)法之間的換算系數(shù)穩(wěn)定可靠，能夠準(zhǔn)確用于上述兩種樣品的粗蛋白總量的計(jì)算。

2.5 檢測方法的穩(wěn)定性試驗(yàn)

為了探索快速法的適用范圍，驗(yàn)證檢測方法的橫向穩(wěn)定性，試驗(yàn)選取5種不同產(chǎn)地的棉粕（樣本1～5）和5種不同產(chǎn)地的魚粉(樣本6～10)，并對其轉(zhuǎn)換系數(shù)的穩(wěn)定性進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果如圖2所示，不同產(chǎn)地的棉粕和魚粉樣品的換算系數(shù)均勻分布在1.715的兩側(cè)，且波動范圍在0.002以內(nèi)。根據(jù)結(jié)果表明，快速法和國標(biāo)法之間的換算系數(shù)在測量不同產(chǎn)地的棉粕和魚粉樣品時波動性較小、穩(wěn)定性較好，利用快速法和換算系數(shù)測定棉粕和魚粉中粗蛋白含量的方法可靠。

圖2 不同產(chǎn)地樣品的換算系數(shù)的穩(wěn)定性

3 小結(jié)

本試驗(yàn)首先利用快速法和繁瑣的國標(biāo)法分別對棉粕樣品的粗蛋白含量進(jìn)行檢測，并對結(jié)果進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)兩種方法間的比值關(guān)系；其次，用粗蛋白含量略高的魚粉驗(yàn)證比值關(guān)系，并確定應(yīng)用快速法和比值結(jié)合計(jì)算樣品中粗蛋白總量的可能性；再次，利用棉粕和魚粉的綜合試驗(yàn)結(jié)果繪制回歸曲線，得出線性方程，確定其自變量X的系數(shù)即換算系數(shù)；最后，隨機(jī)選取5個不同產(chǎn)地的棉粕和魚粉做縱向穩(wěn)定試驗(yàn)，探究快速法對棉粕和魚粉粗蛋白的普遍適用性。經(jīng)過上述試驗(yàn)，最終獲得了一種測定棉粕和魚粉粗蛋白含量的快速方法。

試驗(yàn)結(jié)果表明:利用快速法和換算系數(shù)相結(jié)合，測定棉粕和魚粉粗蛋白含量的快速方法，有如下優(yōu)點(diǎn)：即以過氧化氫作催化劑，利用濃硫酸的放熱實(shí)現(xiàn)消化，且需時短、耗能少；其次，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性高、穩(wěn)定性好，能夠?yàn)轱暳系认嚓P(guān)行業(yè)快速檢測棉粕和魚粉中粗蛋白含量并出具準(zhǔn)確的檢測報告；同時，為相關(guān)物質(zhì)含量的測定提供了新思路，開拓了新途徑。