HBV患者血清miRNA-122、IL-12、IL-4的水平變化及其意義

王艷瑛，魯曉娟

(駐馬店市中心醫(yī)院普外二科，河南 駐馬店 463000)

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus，HBV)感染是肝臟疾病主要病因之一。HBV感染呈全球分布，與肝硬化及肝癌的關系密切，是世界范圍內(nèi)重要的公共健康問題，全球人口的30%有血清學證據(jù)證實現(xiàn)癥或既往感染HBV[1]。micro RNA(miRNA)是一類內(nèi)源性非編碼RNA，它參與癌癥發(fā)生發(fā)展過程中多個通路的調(diào)控[2]。研究表明，mi RNA-122在HBV感染中起著重要的抑制作用，它可能成為新的HBV感染診斷和預后的重要生物標記以及治療靶點[3]。 此外，一些細胞因子（IL-2，IL-4）等在慢性乙型肝炎發(fā)病機制及治療中的作用研究越來越受到人們的關注[4]。本研究探討乙型肝炎病毒（HBV）感染患者血清白細胞介素-12（IL-12）、白細胞介素-4（IL-4）及miRNA-122的水平變化及其意義，報告如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取醫(yī)院確診的HBV感染患者126例（HBV組），另外選取健康體檢對象40例作為對照組，收集時間2014年1月至2017年1月。HBV組，男 62例、女 64例，年齡 28～75歲，平均49.6±18.7歲，其中慢性HBV攜帶者39例、慢性乙型肝炎患者54例、乙型肝炎肝硬化患者33例。對照組，男22例、女18例，年齡22～79歲，平均46.7±15.9歲。兩組患者的年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

1.2 納入排除標準

1.2.1 納入標準 ⑴HBV感染的診斷及患者分組標準參考2010年《慢性乙型肝炎防治指南診斷標準》；⑵患者年齡范圍19～79歲；⑶對照組來源于本院體檢健康的自愿者；⑷本研究獲得研究對象的知情同意。

1.2.2 排除標準 ⑴肝臟腫瘤；⑵合并其他類型肝炎病毒感染；⑶HIV感染；⑷經(jīng)過抗病毒治療。

1.3 miRNA-122檢測 抽取外周靜脈血2ml，置于EDTA抗凝管中，采用Trizol試劑盒（購自美國Invitrogen公司）提取血清總RNA，方法按照試劑盒說明書進行。Nanodrop2000型核酸測定儀上測定RNA濃度，選取U6作為內(nèi)參基因，以cDNA為模板，采用SYBR Premix Ex Taq試劑盒（大連Takara公司）檢測血清miRNA-122水平。

1.4 IL-12、IL-4 患者于早上8點空腹采血5ml，3000r/min進行離心后提取上清，將上清液在-20℃的環(huán)境中保存，IL-12、IL-4使用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法檢測，檢測試劑盒由上海嶸崴達實業(yè)有限公司提供，酶標儀選用Synergy H1全功能酶標儀（美國伯騰儀器有限公司）。

1.5 HBeAg、HBV-DNA、ALT檢測 血清ALT用日本東芝TBA-2000FR全自動生化分析儀和配套試劑進行檢測，測定方法為酶速率法。HBV-DNA采用LightCycler熒光PCR檢測儀，試劑盒為中山大學達安基因公司乙肝病毒(HBV)核酸擴增熒光檢測試劑盒，操作按照說明書進行。采用乙型肝炎診斷試劑盒進行乙肝病毒感染標志物HBeAg檢測。1.6統(tǒng)計學方法 統(tǒng)計軟件采用SPSS 16.0，采用均數(shù)±標準差（x±s）進行統(tǒng)計描述，組間比較采用單因素方差分析法，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗；相關性分析法采用Pearson線性相關分析法；P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組的血清IL-12、IL-4及miRNA-122水平比較 慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的血清IL-12、miRNA-122水平均顯著的高于對照組（P＜0.05），慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者與對照組的血清IL-4水平差異均無統(tǒng)計學意義 （P＞0.05），慢性HBV攜帶者的血清IL-12、miRNA-122顯著高于慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）（表 1）。

2.2 各組的HBeAg、HBV-DNA、ALT水平比較 慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的HBeAg、lg HBVlog10HBV-DNA水平均顯著的高于對照組（P＜0.05），慢性乙型肝炎患者的HBeAg、ALT水平顯著的高于慢性HBV攜帶者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）（表 2）。

2.3 相關性分析 HBV感染患者IL-12、miRNA-122 與 HBeAg、lg log10 HBV-DNA、ALT 呈顯著的正相關性（P＜0.05），IL-4 與 HBeAg、lg log10 HBVDNA、ALT 無明顯的相關性（P＞0.05）（表 3）。

表1 各組的血清IL-12、IL-4及miRNA-122水平比較（x±s）

表2 各組的 HBeAg、HBV-DNA、ALT 水平比較（x±s）

表3 相關性分析

3 討論

乙型肝炎病毒(HBV）簡稱乙肝病毒，是一種DNA病毒，屬于嗜肝DNA病毒科[5]。近年來，乙型肝炎病毒 （HBV）感染是一個嚴重的公共衛(wèi)生問題，在我國尤為突出。慢性HBV感染者可以劃分為慢性乙型肝炎、乙型肝炎肝硬化、慢性HBV攜帶者及隱匿性慢性乙型肝炎[6]。目前，我國乙型肝炎的病原學診斷主要依據(jù)血清HBV感染標記物的檢測結果，主要反映人體對乙肝病毒的免疫反應狀態(tài)。但這種方法的缺點是血清HBV感染標記物組合模式較多，使結果難以判定，因此尋找可靠的檢測指標十分重要。

機體被HBV感染后，引起特異性免疫反應，促進疾病恢復。機體主要通過T淋巴細胞清除入侵的HBV病毒，T細胞既可以作為免疫效應細胞直接殺傷靶細胞，又可以作為免疫調(diào)節(jié)細胞調(diào)節(jié)免疫應答[7]。有研究報道稱，Th1/Th2細胞的比例失調(diào)可能是HBV感染慢性化的原因之一。白細胞介素-12（interleukin-12，IL-12）是由多種免疫細胞產(chǎn)生并作用于多種細胞的一類細胞因子，由Th1細胞分泌。IL-12可刺激活化型T細胞增殖，促進Th0細胞向Th1細胞分化，在抗腫瘤免疫及抗感染免疫中被人們寄予厚望[8]。本研究結果顯示，慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的血清IL-12水平均顯著的高于對照組 （P＜0.05），而且慢性HBV攜帶者的血清IL-12顯著的高于慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）；表明HBV感染患者的IL-12水平較健康人群顯著的增高，并且與患者肝功能、病毒復制、傳染性具有一定的關系。白細胞介素4（interleukin 4，IL-4)是Th2細胞分泌的細胞因子，在調(diào)節(jié)體液免疫和適應性免疫中起關鍵作用。Lu Y等[9]研究發(fā)現(xiàn)，在慢性乙型肝炎中，IL-4升高，體液免疫增強，與HBV持續(xù)感染有關。本研究結果顯示，慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者與對照組的血清IL-4水平差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），可能與HBV感染未能明顯影響Th2細胞合成和分泌IL-4有關，具體機制有待進一步研究。

micro RNA（mi RNA)是長度約 22 nt的內(nèi)源性短鏈RNA，在體內(nèi)可以通過促進靶向基因mRNA的降解，或抑制mRNA翻譯，從而導致靶基因水平下降。研究表明，miRNA參與多種腫瘤細胞的活動，在多種腫瘤中異常表達[10]。腫瘤組織中往往存在特異性miRNA表達量的變化。miRNA在肝癌組織中低表達，但在肝癌患者血清中含量則升高，其表達水平和預后有密切關系[11]。microRNA-122是肝臟的特異性 (miRNA)，占全部肝內(nèi)miRNA的70%，研究表明miRNA-122能調(diào)控HBV的復制[12]。以往研究顯示，慢性乙肝病毒引起肝臟損傷會導致到miRNA-122的升高[13]。但是較少有研究指出其與患者肝功能之間的關系。本研究結果顯示，慢性HBV攜帶者、慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者的血清miRNA-122水平均顯著的高于對照組 （P＜0.05），這與國內(nèi)外研究結果相符合[14，15]。進一步研究發(fā)現(xiàn)，慢性HBV攜帶者的血清miRNA-122顯著的高于慢性乙型肝炎患者、乙型肝炎肝硬化患者（P＜0.05）；而慢性乙型肝炎患者的HBeAg、ALT水平顯著的高于慢性HBV攜帶者、乙型肝炎肝硬化患者 （P＜0.05）。說明血清miRNA-122的表達水平與肝臟損傷程度呈負相關，因此miRNA-122的表達水平有可能成為監(jiān)控慢性HBV感染的血清學指標。

綜上所述，HBV感染患者的miRNA-122、IL-12水平較健康人群顯著的增高，并且與患者肝功能、病毒復制、傳染性具有一定的關系，因此miRNA-122、IL-12在HBV感染患者血清中的表達情況，對該病的早期診斷、治療和預后評估可能有重要意義，需進一步研究闡明其具體功能。

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