人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離與活性關(guān)系的研究

董桂香，王愛(ài)國(guó)，王雷鳴

(鄭州市骨科醫(yī)院，河南 鄭州 450052)

肌酸激酶是人體生物體內(nèi)能量代謝的關(guān)鍵酶，在生物體內(nèi)一些關(guān)鍵耗能的細(xì)胞和組織中均存在分布，肌酸激酶的四種同工酶主要以二聚體形式存在，且腦型肌酸激酶在許多疾病診斷中得到廣泛使用[1，2]。人體基因組中由于單個(gè)核苷酸發(fā)生變化，導(dǎo)致DNA序列產(chǎn)生多樣性，臨床將其稱為單核苷酸多態(tài)性（SNP）[3，4]。 SNP 在人體中含量相對(duì)較高，并且分布較廣，具有一定的遺傳性，并且其表達(dá)水平與人腦肌酸激酶活性有關(guān)，能在一定程度上影響人腦型肌酸激酶結(jié)構(gòu)、功能等，誘導(dǎo)期能力代謝異常[5，6]。本研究旨在探討人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離與活性的關(guān)系，現(xiàn)將研究結(jié)果簡(jiǎn)要報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2013年12月-2016年12月醫(yī)院采集有人腦部組織的患者50例，男28例，女22 例，年齡 38～62 歲，平均（45.64±4.53）歲。疾病類型：24例腦梗死，16例腦出血，10例顱腦外傷。入選患者均符合1996年全國(guó)第四屆腦血管病學(xué)術(shù)會(huì)議中關(guān)于腦血管疾病臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]，均經(jīng)過(guò)生化指標(biāo)、頭顱CT檢查或MRI得到確診。不同患者性別、年齡、疾病類型比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.2 方法 ⑴測(cè)定原理。采用pH-比色法測(cè)定標(biāo)本組織中肌酸激酶的活性，并對(duì)肌酸激酶的底物進(jìn)行反應(yīng)動(dòng)力學(xué)試驗(yàn)。肌酸激酶在催化正向反應(yīng)時(shí)會(huì)隨著ATP向肌酸上轉(zhuǎn)移磷?；耐瑫r(shí)產(chǎn)生相同摩爾的氫離子，其最適宜的pH為7.5～9.0，屬于一個(gè)寬闊的平臺(tái)狀。在該范圍內(nèi)測(cè)定氫離子的生成速度可以作為酶活力的測(cè)定指標(biāo)。⑵腦型肌酸激酶SNP突變體的裂解與分離：取獲得的人腦部組織，加入5mmol/L乙醇，保證溶液PH值為7.5，加入50mmol/L Tris-HCL液支撐勻漿，15min離心，速度為31000r/min，去除沉淀，獲得上層清液I；在磁力攪拌下緩慢加入預(yù)冷的濃度為95.0%乙醇，保證溶液溶度為50.0%，繼續(xù)攪拌30min，15min離心，獲得上層清液Ⅱ。再加入乙醇提高藥物濃度為70.0%，15min離心，速度為3400r/min，去除上層清液Ⅲ，將獲得的沉淀中加入Tris攪拌后均勻，15min離心，速度為31000r/min，獲得上層清液Ⅳ，Tris透析1h后行Q-Sephsrose HP柱層析，控制流速為0.7ml/min。樣品上柱后，利用Tris洗滌，然后再用含0-500mmol/L NaCl的Tris液進(jìn)行梯度洗脫，分別合并CK-BB和NSE峰值管，放置在Tris液中進(jìn)行24h透析，-80℃下貯存，完成腦型肌酸激酶SNP突變體的裂解與分離。由SDS-PAGE與native-PAGE檢測(cè)均為一條帶。⑶檢測(cè)方法。采用280nm光吸收完成酶濃度的監(jiān)測(cè)，人腦部組織消光系數(shù)為8.8。根據(jù)文獻(xiàn)[8]方法進(jìn)行，測(cè)定體系中含有底物肌酸與ATP及鎂離子，利用百里酚藍(lán)作為pH指示劑，利用pH比色法測(cè)定酶的活性[9，10]。結(jié)締組織與神經(jīng)組織后加入150ml濃度為0.01mol/L的KCl，利用組織打碎機(jī)、高速分散器進(jìn)行3次粉碎，每次不超過(guò)30s，冰浴下離心15min，速度為8000r/min，取沉淀進(jìn)行干燥，最終獲得人腦型肌酸激酶樣品。取樣作SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，測(cè)量其亞基分子量，檢測(cè)其是否達(dá)到電泳一條帶的純度，再次取樣采用凝膠層析法測(cè)量該酶的分子量[11，12]。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 18.0軟件處理，計(jì)數(shù)資料行x檢驗(yàn)，采用n（%）表示，計(jì)量資料行t檢驗(yàn)，采用（x±s）表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離活性分析 人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離體對(duì)于酶的抑制反應(yīng)是不可逆的反應(yīng)。從圖1中可以看出產(chǎn)物濃度的對(duì)數(shù)與時(shí)間的變化為線性關(guān)系。通過(guò)曲線的斜率與抑制劑的濃度結(jié)果顯示：A值與SNP突變體二體解離存在正相關(guān)關(guān)系，見(jiàn)圖1。

圖1 人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離活性分析（圖中1、2、3、4、5表示連續(xù)測(cè)定的5個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)）。

2.2 不同氨基酸位點(diǎn)對(duì)人腦型肌酸激酶活性的影響 本課題研究了26、36、59級(jí)267位氨基酸發(fā)生突變的人腦型肌酸激酶SNP突變體活性與二體穩(wěn)定性的關(guān)系，結(jié)果顯示：H26Y、P36T和T59I氨基酸更加容易發(fā)生解離，二體的解離與酶功能喪失成正相關(guān)性。由于空間排阻效應(yīng)影響二體形成蛋白質(zhì)的折疊途徑，導(dǎo)致SNP突變及動(dòng)力學(xué)差異顯著（P<0.05），見(jiàn)表 1。

表1 不同氨基酸位點(diǎn)對(duì)人腦型肌酸激酶活性的影響

3 討論

肌酸激酶在人體腦部組織中含量豐富，不僅存在于星形細(xì)胞中，也存在于神經(jīng)元中，如神經(jīng)元軸突、樹(shù)突、子宮及甲狀腺中，但是這些組織中的肌酸激酶遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于人腦組織中[13]。因此，臨床上將肌酸激酶用于臨床疾病診斷中效果理想，且診斷具有特異性[14]。通常來(lái)說(shuō)，人腦型肌酸激酶水平的升高提示腦部損傷，且從功能可以分為四種：肌肉型、腦型、雜化型和線粒體型。有報(bào)道顯示[15]，細(xì)胞內(nèi)約有1%的氧被用于氧化細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)，并且在衰老動(dòng)物細(xì)胞中氧化的蛋白質(zhì)能占總蛋白質(zhì)的30.0%～50.0%，并且氧化過(guò)程中伴有蛋白質(zhì)的交聯(lián)、多肽鏈的斷裂、不同氨基酸的轉(zhuǎn)化以及氨基酸殘基的修飾。由此看出：人腦型肌酸激酶在人體中蛋白的合成、分解中發(fā)揮了重要的作用。本研究中，人腦型肌酸激酶SNP突變體二體解離體對(duì)于酶的抑制反應(yīng)是不可逆的反應(yīng)。從圖1中可以看出，產(chǎn)物濃度的對(duì)數(shù)與時(shí)間的變化為線性關(guān)系。通過(guò)曲線的斜率能獲得與抑制劑的濃度獲得A，結(jié)果顯示：A值與SNP突變體二體解離存在正相關(guān)關(guān)系。由此看出：人腦型肌酸激酶SNP突變體二聚體解離與活性之間存在一定的相關(guān)性。同時(shí)，人腦型肌酸激酶SNP突變后將會(huì)產(chǎn)生可逆的氧化狀態(tài)，并且這種修飾能引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的變化，并且如果得不到及時(shí)有效的控制，又會(huì)引起進(jìn)一步氧化或其他類型的修飾產(chǎn)生[16]。

本課題研究了26、36、59級(jí)267位氨基酸發(fā)生突變的人腦型肌酸激酶SNP突變體活性與二體穩(wěn)定性的關(guān)系，結(jié)果顯示：H26Y、P36T和T59I氨基酸更加容易發(fā)生解離，二體的解離與酶功能喪失呈正相關(guān)性。由于空間排阻效應(yīng)影響二體形成蛋白質(zhì)的折疊途徑，導(dǎo)致SNP突變及動(dòng)力學(xué)差異顯著（P<0.05）。由此看出：人腦型肌酸激酶SNP突變體二聚體解離與活性之間存在明顯的相關(guān)性，通過(guò)測(cè)定人腦型肌酸激酶水平能了解患者的病情，指導(dǎo)臨床治療，使得患者的治療更具針對(duì)性[17]。

但是，本課題研究過(guò)程中尚存在很多不足，一方面標(biāo)本在測(cè)定時(shí)存在過(guò)多的累積誤差，另一方面本研究屬于是一個(gè)全新的領(lǐng)域，研究過(guò)程中存在的難度相對(duì)較大，對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性及可靠性有待進(jìn)一步研究和探討。綜上所述，人腦型肌酸激酶SNP突變體二聚體解離與活性間存在一定的相關(guān)性，用于一些疾病診斷中效果理想，為臨床治療提供依據(jù)和參考。

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