肝炎、肝硬化、肝癌患者血清干擾素-γ水平的變化及意義

歐陽博慧，謝晴晴，王林春，孫一帆

(1、柳州市中醫(yī)醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 柳州 545001；2、柳州市柳鐵中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣西 柳州 545007)

人感染乙型肝炎病毒（HBV）后的臨床轉(zhuǎn)歸差異巨大，如不積極治療，病情將不斷進(jìn)展，肝臟發(fā)生纖維化，最終導(dǎo)致肝硬化和肝功能衰竭，HBV的慢性感染也是原發(fā)性肝癌諸多致病因素中最主要的致病因素之一。乙型肝炎的發(fā)病與機(jī)體的免疫反應(yīng)有關(guān)，細(xì)胞因子是一類由單核巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等分泌的具有調(diào)節(jié)細(xì)胞功能的多肽物質(zhì)，在機(jī)體的免疫反應(yīng)中與乙肝病毒相互作用，相互影響[1]。干擾素家族是一類具有抗病毒活性的細(xì)胞因子。其中干擾素γ（IFN-γ）屬于細(xì)胞因子中的一種，是病毒感染機(jī)體后，由細(xì)胞分泌的具有抗病毒功能的宿主特異性糖蛋白，是一種重要的巨噬細(xì)胞激活因子。IFN-γ通過與細(xì)胞表面干擾素受體（IFNGR）結(jié)合，誘導(dǎo)多種抗病毒蛋白的產(chǎn)生，從而使病毒感染細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生抗病毒作用，使病毒無法進(jìn)一步損傷宿主細(xì)胞[2]。IFN-γ還能通過干擾細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖。其基因多態(tài)性可能通過影響IFNγ的表達(dá)和分泌改變機(jī)體調(diào)節(jié)的抗病毒和免疫反應(yīng)，從而影響疾病的發(fā)生發(fā)展[3]。IFN-γ的這種抗病毒、抗細(xì)胞增殖、免疫調(diào)節(jié)特性，在肝炎、肝硬化、肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中，參與了多種生理病理過程，并在其中發(fā)揮了關(guān)鍵作用[4]。本研究通過測定血清中的IFN-γ水平在肝炎、肝硬化、肝癌患者中血清學(xué)水平差異，為其應(yīng)用在肝炎、肝硬化、肝癌的早期治療和早期診斷提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 本研究為病例－對照研究。研究對象來源于2016年6月至10月在柳州市中醫(yī)醫(yī)院體檢者和住院患者。正常對照組173例。病例組共347例，其中慢性乙型肝炎（CHB）129例、乙肝后肝硬化（LC）63 例、肝癌（HCC）患者 155 例。

1.1.1 對照組納入標(biāo)準(zhǔn) ⑴無腫瘤或者肝臟、腎臟、內(nèi)分泌、心腦血管等重大疾病史；⑵血清指標(biāo)：乙型肝炎表面抗原 （HBsAg）、乙型肝炎 e抗體（HBeAb）和乙型肝炎表面核心抗體（HBcAb）陰性；甲胎蛋白(AFP)正常；血常規(guī)和生化指標(biāo)正常。納入者為體檢中心健康體檢者。

1.1.2 CHB組納入標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《慢性乙型肝炎防治指南》2015更新版擬定的標(biāo)準(zhǔn)[5]，本研究中CHB組納入標(biāo)準(zhǔn)為HBsAg和HBV DNA陽性且既往有乙型肝炎病史或HBsAg陽性超過6個月的病人。若發(fā)病時間不明，可根據(jù)病人癥狀、生化指標(biāo)、肝組織學(xué)檢查及其它臨床和輔助結(jié)果進(jìn)行判斷。

1.1.3 乙肝后LC組納入標(biāo)準(zhǔn) HBsAg陽性，或HBV DNA陽性，或有明確的乙型肝炎病史。有肝功能異常、有門脈高壓臨床表現(xiàn)或肝硬化的影像學(xué)表現(xiàn)，肝穿刺病理結(jié)果有假小葉形成者可直接確診為LC。

1.1.4 HCC組納入標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范（2017年版）》[6]及2004年版《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[7]：⑴AFP≥400μg/L，能排除妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉(zhuǎn)移性肝癌，并能觸及腫大、堅(jiān)硬及有大結(jié)節(jié)狀腫塊的肝臟或影像學(xué)檢查有肝癌特征的占位性病變者。⑵AFP<400μg/L能排除妊娠、生殖系胚胎源性腫瘤、活動性肝病及轉(zhuǎn)移性肝癌，并有兩種影像學(xué)檢查有肝癌特征的占位性病變或有兩種肝癌標(biāo)志物（DCP、GGTⅡ、AFU 及 CA19-9等）陽性及一種影像學(xué)檢查有肝癌特征的占位性病變者。⑶有肝癌的臨床表現(xiàn)并有肯定的肝外轉(zhuǎn)移病灶(包括肉眼可見的血性腹水或在其中發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞)并能排除轉(zhuǎn)移性肝癌者。本研究遵循倫理學(xué)原則，所有研究對象自愿參與，均已知情同意。

1.2 儀器與方法

1.2.1 標(biāo)本收集 清晨空腹抽取每個研究對象靜脈血3ml裝入無抗凝劑的紅色帽的無菌干燥管內(nèi)，室溫放置30min后，3000r/min轉(zhuǎn)離心10min，取血清保存于-80℃冰箱中，用于血清IFN-γ水平檢測。

1.2.2 測定原理 用ELISA方法進(jìn)行血清中IFN-γ濃度。用純化的抗體包被微孔板，制成固相載體，往包被抗IFN-γ抗體的微孔中依次加入標(biāo)本或標(biāo)準(zhǔn)品，生物素化的抗IFN-γ抗體、辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的親和素，經(jīng)過徹底洗滌后用底物顯色。底物在HRP的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成最終的黃色。顏色的深淺和樣本中IFN-γ呈正比。用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度(OD)值，根據(jù)用標(biāo)準(zhǔn)品繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣本濃度。

1.2.3 測定步驟 ⑴配制標(biāo)準(zhǔn)品：將標(biāo)準(zhǔn)品用1ml樣本稀釋液溶解，充分混勻即為標(biāo)準(zhǔn)品原液。依次進(jìn)行倍比稀釋得到其余6個標(biāo)準(zhǔn)品濃度。以樣本稀釋液為空白。⑵將配制好的8個濃度標(biāo)準(zhǔn)品、樣本加入反應(yīng)板孔中。每孔加 100μl。37℃溫育 2h。棄去液體，甩干，每孔加生物標(biāo)記抗體工作液100μl，37℃溫育1h。棄去孔內(nèi)液體，甩干，在洗板機(jī)上洗板9次后，每孔加入HRP標(biāo)記親和素工作液100μl，37℃溫育 1h。 棄去孔內(nèi)液體，甩干，在洗板機(jī)上洗板9次后，每孔加入底物90μl，37℃避光顯色，當(dāng)肉眼可見標(biāo)準(zhǔn)品有明顯的藍(lán)色梯度時，每孔加入終止液50μl，終止反應(yīng)。反應(yīng)終止后5min內(nèi)在酶標(biāo)儀上，用450nm波長測量各孔的光密度(OD值)。⑶標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制和結(jié)果計(jì)算：在試劑盒廠家網(wǎng)站上下載專業(yè)軟件“Curve Expert 1.4”。根據(jù)提示制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣本OD值，由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)濃度。

1.2.4 所用試劑和儀器 使用人IFN-γ酶聯(lián)免疫試劑盒（96T/盒，cusabio生物科技有限公司，美國）。使用儀器為美國BioTek公司酶標(biāo)儀 （型號：ELX800）。批內(nèi)精密度CV%＜8%；批間精密度CV%＜10%。試劑盒自帶質(zhì)控水平一和水平二，操作步驟同上。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 本研究中的數(shù)據(jù)處理：計(jì)量資料如果符合正態(tài)分布，采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示（x±s），多組比較采用單因素方差分析（One-Way ANO-VA）；若不符合正態(tài)分布，采用中位數(shù)（四分位間距）M（IQR）表示，組間比較用 Kruskal-Wallis檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)使用雙側(cè)概率檢驗(yàn)，以P＜0.05時認(rèn)為結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。數(shù)據(jù)用SPSS 12.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果

2.1 各組研究對象人口學(xué)資料 本研究中的研究對象一般性資料見表1。經(jīng)卡方檢驗(yàn)，四組間男女構(gòu)成比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.758）。經(jīng)方差分析，四組間年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.959）。

表1 各組研究對象人口學(xué)資料

2.2 對照組、CHB組、LC組、HCC組血清中IFN-γ濃度 四組IFN-γ濃度數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差 （x±s）表示，見表2采用單因素方差分析 （One-Way ANOVA）檢驗(yàn)進(jìn)行四組樣本比較。四組血清中IFN-γ濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=9.606，P<0.001）。兩兩比較結(jié)果表明，HCC組和對照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （F=37.110，P<0.000），LC 組和對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=29.638，P=0.012），其它組間比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 對照組、CHB組、LC組、HCC組血清中IFN-γ濃度

3 討論

雖然目前HCC詳細(xì)的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，但公認(rèn)的免疫細(xì)胞功能異常和細(xì)胞因子失衡是HCC發(fā)病機(jī)制之一。機(jī)體免疫系統(tǒng)在HBV感染后被激活，免疫細(xì)胞釋放多種細(xì)胞因子，進(jìn)而形成一個復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。IFN-γ是乙肝相關(guān)性HCC發(fā)病過程中重要的細(xì)胞因子，主要由激活的CD4+、CD8+T細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞產(chǎn)生，T細(xì)胞既可以作為免疫效應(yīng)細(xì)胞直接殺傷靶細(xì)胞，又可以作為免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答[8]。IFN-γ是重要的Th1類細(xì)胞因子，是Ⅱ型干擾素的唯一成員[9]，可以激活并調(diào)節(jié)CD8+細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞(cytotoxic CD8+T-lymphocytes，CTL)和肥大細(xì)胞。 然而，IFN-γ水平與肝臟疾病之間的關(guān)系尚未完全闡明。已有研究發(fā)現(xiàn)IFN-γ可以通過清除病毒的衣殼顆粒及其病毒基因組、使病毒RNA失穩(wěn)等途徑發(fā)揮直接抑制HBV復(fù)制的作用，在先天性和獲得性宿主免疫反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[10]。我們的結(jié)果表明，血清中IFN-γ在研究組中濃度呈不同水平分布，對照組血清中IFN-γ水平明顯高于病例組，HCC組血清中IFN-γ水平最低。因此，IFN-γ血清學(xué)水平可能是一個有價值的肝病檢測指標(biāo)。

我們的結(jié)果提示，HCC患者中IFN-γ水平明顯降低。據(jù)調(diào)查研究統(tǒng)計(jì)，初次感染HBV的成人中，90%~95%能夠依靠自身免疫系統(tǒng)清除病毒而表現(xiàn)為自限性感染或無癥狀感染，僅5%~10%的感染者發(fā)展為慢性肝炎。因此，IFN-γ主要在病毒感染初期發(fā)揮作用。而在長期的炎癥過程中，其水平會受到其它細(xì)胞因子，尤其是Th1類細(xì)胞因子的影響，如IL4、IL10、轉(zhuǎn)化因子β能抑制IFN-γ的產(chǎn)生[11]，這可能是病例組尤其是HCC組IFN-γ水平低于對照組的原因。此外，IFN-γ能夠抑制病毒增殖，調(diào)控細(xì)胞凋亡，其水平可能與肝臟疾病的嚴(yán)重性相關(guān)。如Attallah AM等[12]發(fā)現(xiàn)IFN-γ水平與肝纖維化程度、白蛋白、血小板計(jì)數(shù)、總膽紅素和國際標(biāo)準(zhǔn)化比率（INR）之間存在顯著的關(guān)聯(lián)，IFN-γ參與了乙肝、肝硬化、肝癌等肝病的發(fā)病過程，IFN-γ高水平有利于病毒清除和感染的恢復(fù)，而低水平的IFN-γ有利于病毒逃逸，使病毒持續(xù)復(fù)制導(dǎo)致慢性化感染。研究發(fā)現(xiàn)，IFN-γ的表達(dá)受基因調(diào)控，其血清水平的改變影響HBV清除[3]。另有研究表明，其水平的高低在一定程度上也能夠反映肝細(xì)胞損害的嚴(yán)重程度，其參與了肝臟炎性損傷過程，與肝炎病情輕重密切相關(guān)[1]。目前關(guān)于肝炎、肝硬化、肝癌患者血清中IFN-γ水平差異，各項(xiàng)研究結(jié)果并不統(tǒng)一。甘雪婷等[13]測定了48例肝硬化、40例原發(fā)性肝癌和20例正常對照者血清中的IFN-γ水平，結(jié)果表明肝癌組IFN-γ水平低于肝硬化和正常對照組，這與我們的結(jié)果相似，但我們的研究表明肝癌組和肝硬化組IFN-γ水平并無明顯區(qū)別。陳焰等[14]檢測了30例慢性肝炎和30例肝癌患者的血清標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)慢性肝炎組和原發(fā)肝癌組IFN-γ水平輕度升高，與對照組比較無顯著性差異。Meng等[15]發(fā)現(xiàn)23例肝癌患者IFN-γ水平與正常對照組無明顯區(qū)別，但經(jīng)肝移植后，IFN-γ水平明顯上升。陶鵬輝[16]的研究表明，CHB、LC、PHC三組患者之間血清IFN-γ水平比較無顯著差異，但與健康對照組比，IFN-γ水平明顯增高。標(biāo)本量不同可能是造成結(jié)果不一致，甚至相反的主要原因。

IFN-γ基因多態(tài)性會影響到IFN-γ的表達(dá)。有研究表明，IFN-γ基因+874位點(diǎn)與IFN-γ基因中的CA重復(fù)序列相關(guān)，TT基因型中CA重復(fù)12次，干擾素產(chǎn)量最高[17]。如Saxena R等[18]的研究結(jié)果認(rèn)為HCC組血清中IFN-γ水平最高，其次為對照組；且多重回歸分析結(jié)果表明基因型顯著影響IFN-γ表達(dá)。Arababadi MK等[19]的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)肝炎組血清中IFN-γ水平要高于對照組，且IFN-γ水平與基因型明顯相關(guān)，TT基因型的IFN-γ水平明顯要高于在AA基因型中的水平。在我國，IFN-γ＋874T/A位點(diǎn)存在基因多態(tài)性，在人群中以突變AA基因型為主，占60%以上，其次為TA雜合子，野生型TT基因型所占比例不到10%[20，21]，與國外人群相比，存在明顯的差異[18，22]。廣西是一個少數(shù)民族聚居的地方，我們以前的研究也表明[23]，廣西人群的IFN-γ的TT基因型比例明顯低于其它種族?？梢?，基因背景不同也可能是造成結(jié)果不一致的原因之一，特別是作為IFN-γ高產(chǎn)量的TT基因型所占比例影響較大。

綜上所述，慢性HBV感染是一個由多種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子參與的復(fù)雜過程，各種免疫細(xì)胞和細(xì)胞因子間相互影響、調(diào)節(jié)和制約。IFN-γ血清學(xué)水平在不同的肝病中呈現(xiàn)不同程度的表達(dá)。但應(yīng)注意到其基因多態(tài)性也會對血清學(xué)水平產(chǎn)生影響，因此，結(jié)合血清學(xué)和基因檢測，可能是一個有價值的肝病檢測指標(biāo)。我們將進(jìn)一步擴(kuò)大標(biāo)本量，并結(jié)合甲胎蛋白等檢測指標(biāo)，對IFN-γ應(yīng)用于肝病檢測的特異性和靈敏度進(jìn)行進(jìn)一步研究。

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