急性心肌梗死患者抗心肌肌鈣蛋白I自身抗體與左心室重構(gòu)關(guān)系的分析

周桑，王洪如，薛苗，姚文杰，沈茜，吳豫，秦永文

左心室重構(gòu)是心力衰竭的發(fā)病機制之一，與心臟病患者死亡率的升高有關(guān)[1]。機體免疫系統(tǒng)在心肌損傷后的左心室重構(gòu)過程中扮演了重要角色[2]，在心臟病患者循環(huán)中發(fā)現(xiàn)多種針對心肌細胞的自身抗體，如β1腎上腺素能受體、血管緊張素II受體、心肌肌鈣蛋白、肌凝蛋白等的自身抗體，而健康人循環(huán)中這些自身抗體檢出的頻率卻非常低。有研究認為這些抗心肌蛋白的自身抗體參與了心肌損傷后的心臟擴張和慢性心力衰竭的進展[3，4]。自1996年在一例急性心肌梗死（acute myocardial infarction ，AMI）患者循壞中發(fā)現(xiàn)存在心肌肌鈣蛋白I自身抗體（cardiac troponin I autoantibody ，cTnIAAb）[5]以來，已有多篇文獻報道AMI患者體內(nèi)存在cTnIAAb，該抗體可能與心肌損傷后持續(xù)心肌炎癥反應(yīng)、心肌細胞慢性損傷、心臟收縮功能紊亂、心室重構(gòu)和心力衰竭有關(guān)[6，7]。當然，也出現(xiàn)結(jié)論相左的報道。為了探討這些研究結(jié)果的分歧，我們在前期對AMI患者cTnIAAb的陽性率等研究[8]的基礎(chǔ)上，對AMI患者的臨床數(shù)據(jù)和超聲心動圖進行隨訪長達1年以上，并對AMI發(fā)作期間和隨訪末期兩次檢測數(shù)據(jù)進行分析，以左心室收縮末期容積（left ventricular end systolic volume，LVESV）增加15%以上為左心室重構(gòu)標準[9，10]，評價血清cTnIAAb陽性與左心室重構(gòu)之間的關(guān)系。

1 資料與方法

研究對象：本研究對象為在上海長海醫(yī)院和中國人民解放軍第94醫(yī)院門急診入院的AMI患者131例，診斷標準按照文獻[11]，血清心肌肌鈣蛋白I（cTnI）均≥0.1 μg/ml。其中男性91例，女性40例，平均年齡（69.8±12.2）歲，最大年齡95歲，最小年齡30歲?；颊呷朐簳r診斷為ST段抬高型心肌梗死（ST-elevation myocardial infarction，STEMI）[12]53 例，非ST段抬高型心肌梗死[13]78例。排除其他心血管疾病、自身免疫性疾病、腎臟疾病和肝臟疾病、惡性腫瘤等。所有患者在發(fā)病12小時內(nèi)給予藥物治療或接受經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention ，PCI），出院后均繼續(xù)接受標準的藥物治療，包括阿司匹林、氯吡格雷等。患者臨床數(shù)據(jù)和血清的獲取經(jīng)過上海長海醫(yī)院和中國人民解放軍第94醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

臨床基線資料和血清樣本采集：患者基線資料和臨床數(shù)據(jù)在入院后由兩位有經(jīng)驗的心內(nèi)科醫(yī)生進行采集。包括年齡、男性、心率、高血壓分級、吸煙史、心腦血管疾病史、紐約心臟協(xié)會（NYHA）心功能分級、估算腎小球濾過率（estimated glomerular filtration rate，eGFR）、血清總膽固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、高密度脂蛋白膽固醇（high-density lipoprotein cholesterol ，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）、血清cTnI峰值和血漿B型利鈉肽（Brain natriuretic peptide，BNP）峰值。cTnI峰值和BNP峰值為在整個隨訪期有一個或多個檢測結(jié)果的患者，納入最高值。吸煙史定義為現(xiàn)在或以前曾經(jīng)吸食過煙草。高血壓分級按照2010年中國高血壓指南的標準分為1、2、3級[14]。eGFR按照腎臟病膳食改良實驗簡化公式（modification of diet in renal disease，MDRD）計算[15]。

131例AMI患者在入院12小時內(nèi)抽取血液樣本。另選100名與AMI患者年齡和性別相匹配的健康體檢者為陰性對照，血液樣本由上海長海醫(yī)院健康體檢中心篩選。所有的血清樣本分裝凍存于-20℃，確保篩查cTnIAAb和進行后續(xù)實驗時血清樣本僅凍融一次。

酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA） 檢 測 cTnIAAb：采 用 ELISA檢 測cTnIAAb，按照文獻[8]進行。用碳酸氫鈉緩沖液（pH9.6）稀釋cTnI-TnC融合蛋白10 μg/ml，包被96孔聚苯乙烯板，4℃過夜。血清標本用含3%小牛血清的磷酸鹽緩沖液1：50稀釋，加人預包被的96孔微板中，37℃孵育2小時。加入辣根過氧化物酶標記羊抗人IgG（美國KPL公司），37℃孵育1小時。加入四甲基聯(lián)苯胺，37℃顯色10 min。終止反應(yīng)后，用自動酶標儀在450 nm和630 nm處雙波長比色，各標本A450nm值取三孔均值。

血液檢查指標的檢測方法：膽固醇氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法測定血清TC、甘油磷酸氧化酶-過氧化物酶偶聯(lián)法測定TG、試劑均購自Randox 公司（英國）；直接選擇性測定法測定LDL-C、直接聚乙二醇修飾酶法測定HDL-C（試劑均購自第一化學株式會社，日本），均采用全自動生化分析儀7600-P020（日立公司，日本）測定。血清cTnI測定采用化學發(fā)光免疫分析法（試劑購自Beckman公司，美國）；血漿BNP檢測采用免疫熒光分析法（試劑購自Biosite 公司，美國）。

超聲心動圖檢查：患者心臟結(jié)構(gòu)和心臟功能數(shù)據(jù)由兩名超聲科醫(yī)生采用美國GE VIVIDE9超聲診斷儀檢測。左心室舒張末期直徑（left ventricular end diastolic diameter，LVEDD）、左心室收縮末期直徑（left ventricular end systolic diameter，LVESD）、左心室短軸縮短率（left ventricular fraction shortening，LVFS）采用M型超聲檢測數(shù)據(jù)，左心室舒張末期容積（left ventricular end diastolic volume，LVEDV）、左心室收縮末期容積（LVESV）和左心室射血分數(shù)（left ventricular ejection fraction，LVEF） 按照辛普森積分法估算。

患者隨訪和臨床終點判斷：患者的隨訪時間為2013-11至2015-11。超聲心動圖數(shù)據(jù)在AMI患者首次入院檢測的1年后，用同一型別的設(shè)備進行復查，左心室重構(gòu)定義為隨訪1年后患者的LVESV升高15%以上[9，10]。臨床數(shù)據(jù)通過定期門診隨訪或電話聯(lián)系獲得。

統(tǒng)計學分析：采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件。連續(xù)變量采用均數(shù)±標準差，非正態(tài)分布數(shù)據(jù)采用中位數(shù)（P25，P75）表示。分類變量采用頻率或百分比表示。連續(xù)變量之間的差異采用兩獨立樣本t檢驗、非參數(shù)檢驗比較。分類變量之間的差異采用卡方檢驗比較。各臨床數(shù)據(jù)和左心室重構(gòu)預后價值分析采用Logistic回歸分析比較并計算相應(yīng)的相對危險度（odd ratio，OR）和95%可信區(qū)間（confidence intervals，CI）。所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)都取雙尾，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

ELISA檢測血清cTnIAAb結(jié)果：100名健康體檢者血清cTnIAAb的A450nm平均為0.28±0.12，以均數(shù)±3標準差作為cTnIAAb陽性的臨界值，在本研究中cTnIAAb陽性臨界值為A450nm=0.67。ELISA檢測131例AMI患者血清cTnIAAb的A450nm范圍為0.096～1.623，其中高于陽性臨界值的有23例（17.6%），A450nm范圍為0.72～1.623。100名健康體檢者血清中有2例（2%）A450nm值為0.68、0.72，均高于陽性臨界值。

AMI患者臨床基線數(shù)據(jù)：131例AMI患者中，有23例（17.6%）cTnIAAb陽性，108例（82.4%）cTnIAAb陰性。41例由于未能召回隨訪檢查超聲心動圖，列為失訪，其中有4例cTnIAAb陽性，37例cTnIAAb陰性，失訪病例從研究中剔除。最終90例AMI患者獲得了臨床基線數(shù)據(jù)和兩次超聲心動圖檢查結(jié)果，平均隨訪時間14個月，其中19例（21.1%） cTnIAAb陽性，71例（78.9%） cTnIAAb陰性。cTnIAAb陽性患者與cTnIAAb陰性患者的入院時的臨床基線數(shù)據(jù)見表1，兩者的臨床數(shù)據(jù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 cTnIAAb陽性患者和cTnIAAb陰性患者的臨床資料比較[例(%)]

90例AMI患者隨訪2次超聲心動圖參數(shù)比較（表2）：90例AMI患者隨訪1年后接受了第二次超聲心動圖檢查，38例（42.2%）AMI患者的LVESV擴大超過15%，其中10例（52.6%）為cTnIAAb陽性，18例（25.4%）為cTnIAAb陰性。

表2 cTnIAAb陽性患者和cTnIAAb陰性患者的超聲心動圖檢查結(jié)果（±s）

表2 cTnIAAb陽性患者和cTnIAAb陰性患者的超聲心動圖檢查結(jié)果（±s）

注：#:中位數(shù)（P25，P75）表示。cTnIAAb：心肌肌鈣蛋白I自身抗體；LVEDD：左心室舒張末期直徑；LVESD：左心室收縮末期直徑；LVFS：左心室短軸縮短率；LVEDV：左心室舒張末期容積；LVESV：左心室收縮末期容積；LVEF：左心室射血分數(shù)。與cTnIAAb陰性患者比較*P＜0.05

?

左心室重構(gòu)的危險因素及賦值說明：為了探討這90例AMI患者在發(fā)生AMI后左心室重構(gòu)的危險因素，本研究以隨訪1年后超聲心動圖LVESV增加15%以上列為因變量，并將患者的年齡、性別、吸煙史、NYHA心功能分級、高血壓分級、腦血管事件、糖尿病史、eGFR、LDL-C、cTnI 峰值、血漿BNP峰值、cTnIAAb陽性共12組臨床數(shù)據(jù)作為協(xié)變量納入分析，采用二分類Logistic逐步回歸分析法篩選危險因素，入組標準α入=0.05，刪除標準α出=0.10。經(jīng)過二分類變量Logistic回歸分析，BNP峰值和cTnIAAb陽性為左心室重構(gòu)的危險因素[OR（95%CI）分別為 1.001（95%CI：1.000～1.002）和3.552（95%CI：1.148～10.989），P均為 0.028]。

3 討論

在1996年Bohner等[5]發(fā)現(xiàn)一例AMI患者血清cTnT和肌酸激酶同工酶（CK-MB）在PCI后均升高，cTnI為陰性。進一步研究發(fā)現(xiàn)，該患者循環(huán)內(nèi)存在與cTnI高親和力結(jié)合的自身抗體，引起免疫檢測結(jié)果的假陰性。隨即，在16%擴張型心肌病患者體內(nèi)檢出cTnIAAb[16，17]，在9.2%缺血性心肌病患者循環(huán)中檢出cTnIAAb[18]， 在19.1%的STEMI患者血清中存在cTnIAAb[9]；在本研究中，我們也發(fā)現(xiàn)AMI患者中17.6%患者cTnIAAb陽性。因此，多種心血管疾病患者循環(huán)中存在cTnIAAb已是不爭的事實，但cTnIAAb與心肌細胞病理損傷的關(guān)系和機制是至今仍有爭議，且尚未闡明。

目前，普遍認為心肌細胞損傷釋放的cTnI是導致cTnIAAb產(chǎn)生的始動抗原，而cTnIAAb則可能與導致心肌損傷后持續(xù)的心肌炎癥過程、加重心臟功能慢性損傷和心室重構(gòu)致心力衰竭等有關(guān)[18-20]。然而，也有臨床研究發(fā)現(xiàn)，cTnIAAb水平與患者疾病的程度和進展無關(guān)[7]；在特發(fā)性擴張型心肌病中cTnI升高與患者較差的預后相關(guān)，但對于患者臨床預后的評價作用不明顯[21]。

心肌損傷后的左心室重構(gòu)嚴重影響心肌梗死患者的預后。本研究對90例AMI患者血清cTnIAAb檢測情況和與左心室重構(gòu)相關(guān)的部分臨床危險因素進行了數(shù)據(jù)采集和跟蹤評價，發(fā)現(xiàn)血清cTnIAAb陽性患者與cTnIAAb陰性患者在入組的基線數(shù)據(jù)和超聲心動圖檢查數(shù)據(jù)間沒有差異。然而，平均隨訪1.4年后，cTnIAAb陽性患者的LVEDV及LVESV均出現(xiàn)顯著性升高；且LVESV增加更為明顯。cTnIAAb陽性組有10例（52.6%）LVESV增加超過15%，而cTnIAAb陰性組僅25.4%患者升高。以左心室重構(gòu)為標準對12個常見相關(guān)危險因素進行二分類Logistic回歸分析結(jié)果強烈提示：AMI患者cTnIAAb陽性與心肌損傷后左心室病理性重構(gòu)存在較密切因果關(guān)系。

cTnIAAb與心肌損傷后心室病理性重構(gòu)的直接關(guān)系和機制至今仍未闡明?，F(xiàn)有研究已發(fā)現(xiàn)：cTnIAAb對心肌細胞有直接毒性作用[7,22-24]；cTnI免疫小鼠會引起cTnIAAb水平升高，并出現(xiàn)小鼠心肌炎癥、心臟擴張、心功能下降和死亡率增加[25]。這些結(jié)果均表明，cTnIAAb直接介導了心肌細胞的毒性反應(yīng)或早期的炎癥。cTnIAAb是如何接觸到心肌細胞胞漿內(nèi)的靶抗原？這是無法回避的問題。有研究者采用膠體金標記抗cTnI抗體給小鼠靜脈注射，電鏡在心肌細胞膜T管和I帶的表面發(fā)現(xiàn)了金顆粒，證明心肌細胞膜存在cTnI表達[23]。盡管該文在后續(xù)相關(guān)的研究中被多次引用，認為cTnIAAb與心肌細胞膜表達的cTnI相結(jié)合“觸發(fā)”機體的自身免疫應(yīng)答，從而造成心肌細胞的病理損傷。然而，這些假設(shè)仍需進一步的實驗驗證。

通過本研究我們證實，AMI患者循環(huán)中cTnIAAb陽性是心肌損傷后左心室病理性重構(gòu)的獨立危險因素之一，也提示cTnIAAb參與了AMI后心室重構(gòu)的病理過程。然而，要闡明其中的病理生理機制，尚需大量研究工作。

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