組織蛋白酶S抑制劑影響小鼠缺血誘導(dǎo)的血管新生的機(jī)制研究

李洋，樸穎，類延娜，成憲武，李香

組織蛋白酶S（cathepsins S，CatS）是一類蛋白水解酶，它們廣泛地分布在人體各種細(xì)胞的溶酶體中，主要參與細(xì)胞溶酶體內(nèi)蛋白質(zhì)再利用[1]。目前為止，在人體組織及細(xì)胞發(fā)現(xiàn)了11種組織蛋白酶。其家族中，研究表明，CatS是一種在細(xì)胞內(nèi)、外都具有很強(qiáng)生物活性（如膠原，彈性蛋白等分解活性）的半胱氨酸蛋白酶。2012年，Circulation雜志發(fā)表的文章闡明了組織蛋白酶通過細(xì)胞外基質(zhì)分解及在心血管細(xì)胞和炎癥-免疫細(xì)胞生物行為中，促進(jìn)各種心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展[2]。過氧化物酶增殖物激活受體（peroxidase proliferation activated receptors ，PPAR）是核受體超家族成員。PPAR 包括 PPAR-α、PPAR-β/δ 和 PPAR-γ三種表型[3]。由于PPAR 參與調(diào)控機(jī)體眾多病理生理過程，以此為靶點(diǎn)，開發(fā)和利用它們的高選擇性激動(dòng)劑具有重要的科學(xué)意義及廣闊的應(yīng)用前景。目前較多的研究集中于CatS在動(dòng)脈硬化性心血管疾病中的表達(dá)及其作用，而CatS在缺血性血管生成中表達(dá)及其作用鮮有報(bào)道[4]。本研究旨在觀察CatS抑制劑（CatS-I）影響小鼠缺血誘導(dǎo)的血管新生機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物來源與分組

將8周齡、體重21～25 g的野生型小鼠（C57/BL6，由日本名古屋大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室提供）按照隨機(jī)數(shù)字表法分為兩組：對照組和CatS-I組，每組各20只。對照組采用基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)基礎(chǔ)上再注射5%羧甲基纖維素鈉鹽（CMC），每天1次，腹腔注射，共17天；CatS-I組在基礎(chǔ)飼料飼養(yǎng)基礎(chǔ)上再注射CatS-I[1 mg/（kg·d）]，每天 1次，腹腔注射，共17天。兩組腹腔注射3天后建立下肢缺血模型。分別測定術(shù)前、術(shù)后即刻、4天、7天、14天的下肢血流；術(shù)后第4天利用蛋白免疫印跡（Western）雜交技術(shù)檢測PPAR-γ、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化內(nèi)皮一氧化氮合酶（p-eNOS）和血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelia growth factor, VEGF）等蛋白表達(dá)水平；術(shù)后第7天，取缺血骨骼肌制作冰凍切片，采用免疫組織化學(xué)方法測定毛細(xì)血管密度。

1.2 試劑

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）購自于美國Cell signaling Technology 公司；p-Akt 購自于美國 Cell signaling Technology公司；蛋白激酶B（Akt）購自于美國Santa Cruz Biotechnology公司；p-eNOS （Ser1177）購自于美國BD Biosciences公司；eNOS購自于美國BD Biosciences公司；PPAR-γ購自于美國Abcam公司；CD31 單克隆抗體購自于美國 Santa Cruz 公司。

1.3 小鼠單側(cè)下肢缺血模型的建立

小鼠腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）進(jìn)行麻醉，麻醉后進(jìn)行脫毛，采取仰臥位固定，切開小鼠左側(cè)下腹部皮膚后，首先分離股神經(jīng)后結(jié)扎股動(dòng)脈根部，剝離股動(dòng)脈三個(gè)主要分支并結(jié)扎，然后切除股動(dòng)脈主干及其分支，建立下肢缺血模型。

1.4 蛋白免疫印跡法檢測蛋白水平

用蛋白裂解液提取細(xì)胞或組織總蛋白，按試劑盒說明進(jìn)行，測提取液的蛋白質(zhì)水平。通過聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳、轉(zhuǎn)膜、雜交、顯色、分析等步驟檢測靶蛋白的表達(dá)水平。該實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。信號通路的檢測：檢測當(dāng)日肌肉組織的總蛋白，用BCA定量法檢測蛋白含量。取10μg蛋白上樣到12.5% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，然后電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上。5%脫脂牛奶封閉，4℃過夜。分 別 加 入 GAPDH、p-Akt、Akt、p-eNOS、eNOS、PPAR-γ。室溫孵育1 h， 用TBST緩沖液[TrisHCL（1mmol/L，pH 7.5）：50 ml、Nacl：8 g、KCL：0.2 g、吐溫：0.5 ml ，加蒸餾水定容至1 L]搖動(dòng)洗膜3次 （10 min/次）。加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG （美國ROCKLAND公司），室溫孵育1 h，用TBST搖動(dòng)洗膜三次 （10 min/次）。最后進(jìn)行熒光掃描，應(yīng)用圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行光密度掃描、分析[5]。

1.5 缺血下肢肌肉組織中毛細(xì)血管密度的判斷和計(jì)數(shù)

采用激光多普勒血流成像儀（瑞典Lisca Development，Linkoping公司）測量術(shù)前、術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)的缺血側(cè)（左側(cè)下肢）和對側(cè)非缺血側(cè)（右側(cè)下肢）的血流灌注情況。每次測量之前，小鼠腹腔注射戊巴比妥（60 mg/kg）進(jìn)行麻醉，麻醉后采取仰臥位，置于37℃條件下15 min。仰臥位掃描之后，存儲(chǔ)圖像，圖像存儲(chǔ)形式為整個(gè)雙下肢區(qū)域的二維圖像，經(jīng)過PIMⅡ Patch Test WIZARD軟件分析，血流灌注情況用激光多普勒血流平均值表示。用每只小鼠同一時(shí)間點(diǎn)的缺血側(cè)與非缺血側(cè)的下肢血流灌注的比值表示同只鼠的缺血下肢血流恢復(fù)情況。

下肢肌肉組織行冰凍切片（5 μm），采用CD31單克隆抗體免疫組化染色法標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞以測定毛細(xì)血管數(shù)量和密度。取5個(gè)肌肉橫切面視野，計(jì)算每個(gè)視野的毛細(xì)血管數(shù)量，取其平均值。毛細(xì)血管密度用每高倍視野（×400）下，毛細(xì)血管與肌纖維數(shù)量的比值表示[6]。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

應(yīng)用免疫組織化學(xué)檢測試劑盒（丹麥DAKO公司產(chǎn)品）及與增殖相關(guān)的CD31單克隆抗體（美國Santacruz/Cell Signaling公司產(chǎn)品）。染色步驟按說明書操作步驟進(jìn)行。為證明抗體免疫組化檢測特異性，實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用了免疫動(dòng)物IgG代替一抗作為陰性對照[5]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS15.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用Tukey post hoc test 進(jìn)行多重比較。計(jì)數(shù)資料的比較采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組缺血與非缺血下肢血流的動(dòng)態(tài)變化（圖1）

CatS-I組明顯抑制下肢血流的恢復(fù)。術(shù)后即刻、術(shù)后1天血流明顯下降，術(shù)后第4天開始血流逐漸恢復(fù)，術(shù)后第14天CatS-I組小鼠缺血下肢血流恢復(fù)明顯慢于對照組（P＜0.05）。

圖1 兩組的激光多普勒血流成像（1A）和缺血側(cè)與非缺血側(cè)下肢血流灌注的比值統(tǒng)計(jì)圖（1B）

2.2 利用CD31免疫組織化學(xué)染色觀察兩組骨骼肌毛細(xì)血管的形成（圖2）

術(shù)后第14天， 與對照組比較，CatS-I組的非缺血骨骼肌中毛細(xì)血管形成略減少，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但缺血骨骼肌中毛細(xì)血管形成明顯受阻。毛細(xì)血管密度統(tǒng)計(jì)圖（圖2B）表明，CatS-I組小鼠的毛細(xì)血管密度明顯低于對照組（P＜0.01）。

圖2 術(shù)后第14天兩組小鼠缺血與非缺血骨骼肌中毛細(xì)血管密度比較（×400）

2.3 蛋白免疫印跡雜交法檢測兩組與血管新生有關(guān)分子的蛋白水平表達(dá)（圖3）

PPAR-γ、p-Akt、p-eNOS和VEGF等蛋白的免疫印跡圖和表達(dá)水平的定量分析結(jié)果表明：CatS-I組小鼠中，PPAR-γ、p-Akt、p-eNOS和VEGF等蛋白水平與對照組比較明顯減少（P＜0.05）。

圖3 蛋白免疫印跡法比較兩組小鼠缺血與非缺血骨骼肌中蛋白表達(dá)水平

3 討論

2004 年，Cheng等[7,8]報(bào)道了CatS 在損傷性增生內(nèi)膜及心力衰竭心肌中表達(dá)明顯增高，并在心血管重構(gòu)中起著重要作用。此后，也發(fā)現(xiàn)CatS主要在血管平滑肌細(xì)胞膜外與ανβ3 整合素結(jié)合，調(diào)控平滑肌細(xì)胞的移動(dòng)及浸潤功能[9]。藥物干預(yù)CatS 可以抑制動(dòng)脈斑塊形成及改善斑塊穩(wěn)定性[10]。這些研究結(jié)果提示，CatS 參與動(dòng)脈粥樣斑塊形成、發(fā)展、破裂和破裂后修復(fù)的全過程。以往的散在報(bào)道顯示：一方面，CatS通過降解、失活堿性成纖維細(xì)胞生長因子（basic fibroblast growth factor，BFGF）或分解Ⅳ型膠原蛋白產(chǎn)生具有抗血管新生活性的血管抑制素，另一方面，通過修飾以及釋放血管生長調(diào)節(jié)因子控制腫瘤血管新生[11]。許多動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究顯示：骨髓和外周血血管內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell, EPC）細(xì)胞移植可以促進(jìn)缺血性血管新生、改善缺血癥狀[12]。本研究結(jié)果表明：CatS-I明顯抑制下肢血流的恢復(fù)及毛細(xì)血管的形成。揭示：CatS在動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，亦可能參與血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cell，EC）和EPC 的功能調(diào)控。下肢缺血性疾病最主要的病因?yàn)閯?dòng)脈粥樣硬化，因此，CatS 可以成為參與缺血性血管新生的關(guān)鍵成員。

研究結(jié)果公認(rèn):PPAR-γ主要表達(dá)在脂肪組織，它介導(dǎo)脂肪細(xì)胞分化，并在糖和脂肪酸代謝中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用的重要基因。最近，PPAR-γ在心血管系統(tǒng)和炎癥-免疫細(xì)胞中表達(dá)及其作用越來越受到重視。2013 年，Kroller-Schon 等[13]的主要研究成果闡明了PPAR-γ共激活因子（PPAR-γ coactivator-1α， PGC-1α） 具有抵抗血管緊張素誘導(dǎo)的血管損傷和炎癥反應(yīng)。Wolf等[14]發(fā)現(xiàn)，PPAR-γ阻滯劑可以抑制Akt的磷酸化，從而通過抑制上述內(nèi)皮細(xì)胞的遷移作用而發(fā)揮作用。另有研究表明：PPAR-γ激活通過降低腫瘤壞死因子-α（TNF-α）分泌改善糖尿病小鼠胰島素抵抗[15]。隨后的研究還證實(shí)了PGC-1α通過促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的VEGF合成，促進(jìn)EC的血管形成效應(yīng)[16]。內(nèi)皮素-1可以減弱在慢性肺動(dòng)脈高壓動(dòng)物宮內(nèi)內(nèi)皮細(xì)胞的PPAR-γ通路，且抑制血管新生[14]。另一方面，PPAR-γ 激動(dòng)劑通過絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein K inase，MAPK）-PGC-1α-eNOS-NO 通路抗 EC 凋亡[17]。

綜上，CatS-I明顯抑制下肢血流的恢復(fù)及毛細(xì)血管的形成，CatS-I組小鼠中，PPAR-γ、p-Akt、p-eNOS和VEGF等蛋白水平與對照組比較明顯減少。因此，CatS在缺血性血管新生中的作用可能是CatS通過PPAR-γ激活及PI3K/Akt/eNOS 信號通路調(diào)控EPC分化，增殖及血管生成機(jī)制。CatS有望成為治療缺血性心血管疾病的新的分子靶點(diǎn)。

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