基于1H-NMR技術(shù)尋找非酒精性脂肪肝肝郁脾虛證的差異代謝標(biāo)志物?

李若瑜，苗宇船△，蘇趙威，賈 飛，李明磊，劉 楊，郭繼龍，關(guān) 偉，張冉冉，何麗清

(1. 山西中醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 030619； 2. 建德市中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，浙江 建德 311612)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是遺傳-環(huán)境-代謝應(yīng)激相關(guān)性疾病。本研究采用核磁共振技術(shù)(1H-NMR)分析NAFLD肝郁脾虛證模型大鼠血清中內(nèi)源性代謝物濃度的變化，以期篩選出與NAFLD肝郁脾虛證相關(guān)的代謝標(biāo)志物，為揭示NAFLD的發(fā)病機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠16只，體質(zhì)量200～220 g，北京海淀興旺實(shí)驗(yàn)動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)SCKK(京)2014-0013)，常規(guī)適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要儀器與試劑

5-羥色胺(5-HT)試劑盒、去甲腎上腺素(NE)試劑盒購自中生北控生物科技股份有限公司；D-木糖排泄率測(cè)定試劑盒購自北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；600 MHz AVANCE III NMR波譜儀，德國(guó)Bruker公司；美國(guó)Image-Pro Plus v5.1圖像分析管理系統(tǒng)；D2O，購自美國(guó)merck試劑公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 NAFLD肝郁脾虛證動(dòng)物模型的建立 將實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組和模型組各8只，對(duì)照組給予基礎(chǔ)飼料喂養(yǎng)，自由飲水；模型組給予高糖高脂飼料+饑飽失常法+慢性束縛應(yīng)激刺激+夾尾法，建立NAFLD肝郁脾虛證動(dòng)物模型[1-2]。12周末麻醉采血，常規(guī)制備血清，標(biāo)本儲(chǔ)存于-80 ℃冰箱中備用。取肝左葉石蠟包埋切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察肝臟組織學(xué)變化。

1.3.2 樣本預(yù)處理 取解凍后血清450 μL，加入D2O350 μL渦旋30 s，于4 ℃ 13000 r/min離心20 min，取上清液600 μL，置于內(nèi)徑5 mm的NMR樣品管中備用。

1.3.3 1H-NMR圖譜處理 采用 Mest Re Nova 核磁圖譜專業(yè)處理軟件對(duì)所有1H-NMR圖譜進(jìn)行傅立葉轉(zhuǎn)換并進(jìn)行相位、基線調(diào)整,以TSP 的化學(xué)位移δ 3.04為標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行化學(xué)位移校正。以δ 0.01為單位，對(duì)δ 0.01～8.50區(qū)域的譜圖進(jìn)行等寬度分割,去除δ 4.67～4.90區(qū)域水峰；對(duì)圖譜進(jìn)行分段積分,將積分?jǐn)?shù)據(jù)歸一化處理,使數(shù)據(jù)集中在 0～1 內(nèi)用于多元統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 NAFLD肝郁脾虛證模型復(fù)制驗(yàn)證結(jié)果

2.1.1 一般行為學(xué)特點(diǎn) 模型組大鼠表現(xiàn)為明顯厭食，體質(zhì)量減輕，行動(dòng)遲緩，弓背靜臥，背毛散亂無光澤，糞便溏軟。

2.1.2 NAFLD病理組織學(xué)結(jié)果 圖1、2顯示，對(duì)照組大鼠可見正常肝組織形態(tài)；模型組大鼠肝細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)有大小不等的脂肪空泡,將細(xì)胞核擠壓至一側(cè)(黑色箭頭所示),肝小葉、門管區(qū)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，表明大鼠非酒精性脂肪肝模型復(fù)制成功。

表1 各組大鼠GLU、FFA、5-HT、NE、D-木糖排泄率變化比較

注： 與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖1 對(duì)照組大鼠肝組織病理切片(HE染色 ×400)

圖2 模型組大鼠肝組織病理切片(HE染色 ×400)

2.1.3 肝郁脾虛證指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 表1顯示，與對(duì)照組比較模型組血糖、血脂升高，5-HT、NE和D-木糖排泄率顯著降低(P<0.05)，成功建立大鼠肝郁脾虛證模型。

圖3 大鼠血清1H-NMR圖譜注：1.丙酮[2.24(s)]；2.精氨酸[1.72(m)3,25(t)]；3.丙氨酸[1.48(d)3.77(q)]；4.甜菜堿[3.28(s)]；5.肌酐[3.04(s)3.94(s)]；6.α-D-葡萄糖[5.24(d)3.23(t)]；7.β-D-葡萄糖[4.65(d)]；8.二甲基甘氨酸[2.92(s)3.70(s)]；9.3-羥基丁酸[1.20(d)]；10.甘油[3.54(dd)3.66(dd)]；11.糖原[5.39(s)]；12.異亮氨酸[0.99(d)3.65(d)]；13.α-酮戊二酸[2.44(t)]；14.乳酸[1.33(d)、4.12(q)]；15.亮氨酸[0.96(t)]；16.賴氨酸[1.72(m)1.90(m)]；17.肌醇[3.53(d)]；18.N-乙酰糖蛋白[2.05(s)]；19.O-乙酰糖蛋白[2.14(s)]；20.琥珀酸[2.37(s)]；21.蘇氨酸[1.33(d)3.58(d)4.24(q)]；22.酪氨酸[6.89(d)]；23.纈氨酸[1.01(d)3.61(d)]

2.2 代謝組學(xué)結(jié)果

2.2.1 圖3顯示，1H-NMR圖譜的指認(rèn)與分析 通過大鼠血清1H-NMR圖譜，結(jié)合HMDB數(shù)據(jù)庫指認(rèn)出23種代謝產(chǎn)物，各物質(zhì)對(duì)應(yīng)化學(xué)位移與峰型。

2.2.2 多元統(tǒng)計(jì)分析 圖4、5顯示，運(yùn)用SIMCA-P+ 進(jìn)行PLS-DA分析得出積分圖和S-plot圖。圖4顯示，模型組與對(duì)照組明顯沿t[1]軸分開，提示組間差異明顯，模型R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875，即其中43.6%的變量作為主要成分構(gòu)造模型，模型的解釋率99.9%，模型的預(yù)測(cè)率87.5%。圖5中“S”曲線上的點(diǎn)離原點(diǎn)越遠(yuǎn)，其VIP值越大，代謝產(chǎn)物差異越明顯。由圖中可以找到VIP>1差異顯著的代謝產(chǎn)物。

2.2.3 尋找差異代謝產(chǎn)物 表2顯示，運(yùn)用SPSS17.0軟件對(duì)所有代謝物的相對(duì)峰面積進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)者結(jié)合S-Plot圖的VIP值進(jìn)行多元統(tǒng)計(jì)，得出9種可能是中醫(yī)證候潛在生物標(biāo)志物的差異代謝物，并對(duì)其相對(duì)峰面積的變化進(jìn)行計(jì)算。

圖4 大鼠血清1H-NMR下PLS-DA積分圖注：PC=3，R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875

圖5 大鼠血清1H-NMR下S-plot圖注：PC=3，R2X=0.436，R2Y=0.999，Q2=0.875

代謝物化學(xué)位移(ppm)變化趨勢(shì)峰面積對(duì)照組模型組丙酮2.24+1.98×10-1±6.50×10-24.12×10-1±1.15×10-1**丙氨酸1.48-7.00×10-1±8.80×10-24.51×10-1±1.22×10-1**甜菜堿3.28+5.30×10-1±1.50×10-11.01×10-0±4.00×10-1*α-D-葡萄糖5.24+6.63×10-1±1.58×10-19.13×10-1±1.07×10-1**甘油3.66+2.12×10-1±2.20×10-23.25×10-1±7.10×10-2**異亮氨酸3.65+1.86×10-1±1.90×10-22.54×10-1±3.70×10-2**α-酮戊二酸2.44+2.15×10-1±4.10×10-23.33×10-1±8.60×10-2**蘇氨酸3.58+1.02×10-1±2.00×10-21.41×10-1±2.10×10-2**賴氨酸1.72+1.41×10-1±3.80×10-21.83×10-1±4.30×10-2*

注： 與對(duì)照組比較:*P<0.05,**P<0.01

3 討論

NAFLD是代謝綜合征在肝臟的表現(xiàn)，其基本病理過程是以脂質(zhì)攝取過多和胰島素抵抗為首要環(huán)節(jié)引起脂肪在肝臟細(xì)胞儲(chǔ)積，涉及能量代謝紊亂和脂質(zhì)過氧化、免疫應(yīng)答紊亂等復(fù)雜過程。中醫(yī)認(rèn)為，肝與脾在生理病理上聯(lián)系密切，肝主疏泄，脾主升清、運(yùn)化，疏泄與運(yùn)化相互為用。肝郁脾虛證的主要病機(jī)即肝失疏泄、脾失健運(yùn)，正對(duì)應(yīng)NAFLD過程中的物質(zhì)能量代謝紊亂。NAFLD導(dǎo)致肝細(xì)胞受損后，肝臟代謝組分的變化可通過檢測(cè)血液獲得[3]，因此對(duì)NAFLD肝郁脾虛證的血清代謝組學(xué)研究具有重要意義。

模型組血清中甘油與FFA水平升高，可能提示機(jī)體內(nèi)脂肪酸水平升高，而過量的脂肪酸在氧化過程中產(chǎn)生大量ROS，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂肪變性和壞死。甜菜堿可分解為三甲胺，是脂質(zhì)代謝的中間產(chǎn)物，其在甘氨酸合成時(shí)提供甲基，減輕脂質(zhì)過氧化作用，增加脂類代謝。模型組中甜菜堿的增多提示脂質(zhì)代謝增多。

胰島素抵抗貫穿NAFLD整個(gè)過程，最直觀的判定特征就是葡萄糖的攝取利用，模型組大鼠血糖明顯升高，提示組織對(duì)葡萄糖的利用率降低。丙酮是脂肪酸分解時(shí)產(chǎn)生的酮類化合物，其含量升高提示能量代謝的過程從葡萄糖利用轉(zhuǎn)為脂肪酸氧化。血清α中-酮戊二酸增加，表明三羧酸循環(huán)封閉[4]。

肝臟作為氨基酸代謝的中心，任何肝損傷都可能干擾氨基酸的代謝[5]。肝細(xì)胞膜損傷使細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成受到抑制，對(duì)氨基酸清除率降低，對(duì)胰高血糖素的滅活降低，導(dǎo)致內(nèi)源性蛋白處于高分解狀態(tài)，釋放出大量的氨基酸，使血中氨基酸水平增高[6]。模型組大鼠異亮氨酸水平升高，提示機(jī)體啟動(dòng)了支鏈氨基酸的糖異生作用，以補(bǔ)充機(jī)體所需的能量[7]。蘇氨酸可與寡糖鏈結(jié)合，對(duì)保護(hù)肝細(xì)胞膜起重要作用，亦能促進(jìn)磷脂合成和脂肪酸氧化，其水平升高可能是機(jī)體對(duì)NAFLD產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)的結(jié)果，丙氨酸水平下降則與糖尿病等胰島素抵抗引起的疾病有關(guān)。

有研究表明[8]，糖類、脂類、蛋白質(zhì)的代謝紊亂可能是中醫(yī)證候的物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)測(cè)定了血清中9種與NAFLD相關(guān)的內(nèi)源性代謝物含量的變化并進(jìn)行綜合分析，從脂質(zhì)代謝紊亂、胰島素抵抗及氨基酸代謝紊亂等不同方面反映出NAFLD肝郁脾虛證的部分發(fā)病機(jī)制，有利于確定NAFLD肝郁脾虛證特征性的代謝變化，為證候客觀化研究提供了新的方法與思路。

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