補骨脂素對前列腺癌LNCaP-AI細胞增殖和周期調(diào)控及雌激素受體β表達的影響

李少鵬 蔡建通 翁銘芳 游翰林 陳書尚 吳衛(wèi)真

前列腺癌高居美國男性死亡首位，在我國的發(fā)病率逐年上升[1]。在前列腺癌的臨床治療中，早期的去勢治療非常有效，但是經(jīng)過一段時間的激素治療，多數(shù)患者轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に氐挚剐郧傲邢侔╟astrationresistant prostate cancer，CRPC），目前臨床上仍缺乏有效的治療措施[2]。因此，尋找前列腺癌治療的新型藥物將是提高前列腺癌患者治療效果、延長患者壽命的關(guān)鍵。越來越多的證據(jù)表明，雌激素及其受體對于前列腺癌的發(fā)展和發(fā)作起著重要作用，成為近年來前列腺癌的研究熱點之一[3-5]。研究表明，補骨脂素是一種重要的植物雌激素，通過雌激素受體（estrogen receptor，ER）介導發(fā)揮作用。本研究觀察了補骨脂素在體外對雄激素非依賴性前列腺癌LNCaP-AI[6-7]細胞增殖、周期變化和細胞增殖相關(guān)蛋白Ki67表達的影響，并通過檢測LNCaP-AI細胞中雌激素受體β（ERβ）的表達情況，探討其作用機制。

材料與方法

一、材料

補骨脂素（中國西亞公司），胎牛血清（美國HyClone公司），兔抗人Ki67抗體和兔抗人ERβ抗體（美國 Abcam 公司），鼠抗人 β-actin抗體（美國Sigma公司），Western bright ECL蛋白顯色液（美國Advansta公司），EvoScipt RNA SYBR Green I Master試劑盒（瑞士Roche公司），LNCaP-AI細胞（第二軍醫(yī)大學孫穎浩教授惠贈）。

二、方法

1.細胞培養(yǎng)及分組：LNCaP-AI細胞用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液在37 ℃、5﹪ CO2、飽和濕度下培養(yǎng)，融合達80﹪時，以0.25﹪胰蛋白酶進行消化后傳代，取對數(shù)生長期細胞進行實驗。設(shè)空白對照組和不同終濃度補骨脂素組。

2. CCK-8試劑盒檢測細胞增殖：待體外培養(yǎng)的LNCaP-AI細胞生長至80﹪融合時，用胰蛋白酶消化細胞，移液槍吹打均勻，普通光學顯微鏡下計數(shù)，細胞以5×103個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)8 ～ 12 h，分別加入不含補骨脂素細胞培養(yǎng)液、含10，30，50，100 μg/ml補骨脂素的細胞培養(yǎng)液 100 μl，每個濃度設(shè)置 5 個復孔。分別培養(yǎng) 24，48，72，96 h后，吸棄培養(yǎng)基，加PBS洗滌1 次，每孔加入10 μl CCK- 8+ 90 μl細胞培養(yǎng)液，以無細胞的空白孔加入10 μl CCK-8+ 90 μl細胞培養(yǎng)液為空白對照，于 2 h后用多波長酶標儀在450 nm處檢測吸光度。以細胞存活率（T/C﹪）=（實驗組細胞OD/對照細胞OD）×100﹪計算細胞的存活率。

3. Western blot法檢測Ki67蛋白表達：LNCaPAI細胞懸浮后接種，按分組加入不同終濃度補骨脂素（0，30，50，100 μg/ml），培養(yǎng) 48 h，收集細胞，加入細胞裂解液，提取總蛋白并測定蛋白濃度。取等量蛋白，95 ℃水浴15 min，使蛋白充分變性，經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電轉(zhuǎn)至預先用甲醇活化的PVDF膜，5 ﹪牛奶4 ℃封閉1 h，根據(jù)檢測目的，分別加入用封閉液稀釋的一抗（Ki67、β-actin）4 ℃孵育過夜，TBST洗滌后，二抗室溫孵育1 h，洗膜后滴加ECL蛋白顯色液顯色。取目標條帶測灰度值，所有實驗均重復3次。

4.流式細胞術(shù)檢測細胞周期：LNCaP-AI細胞傳代，待 8 ～ 12 h細胞貼壁，分別加入含 0，10，30，50，100 μg/ml補骨脂素的細胞培養(yǎng)液 12 ml，分別培養(yǎng)48 h后，胰蛋白酶消化細胞，離心后加入預冷的無水乙醇，4 ℃下固定 24 h，離心洗滌，加入 500 μl PBS+5 μl PI+25 μl RNase，震蕩懸浮后按照流式細胞儀檢測程序檢測各組細胞周期。

5.實時定量RT-PCR檢測ERβ mRNA表達：LNCaP-AI細胞懸浮后接種，分別加入不同終濃度補骨脂素（0，30，50，100 μg/ml），培養(yǎng) 48 h，收集細胞。采用一步法熒光定量PCR檢測LNCaP-AI細胞ERβ mRNA表達。步驟如下：收集2×106個細胞到離心管，加入裂解液裂解并靜置后取上清液，過柱、洗滌，最后加入洗脫液50 μl，分別得到各組的總RNA模板。ERβ引物由中國華大基因公司合成（表1）。按照反應(yīng)體系：PCR Grade Water 10 μl+Master 4 μl+Primer Mix 1 μl，分別加入各組的 RNA 模板。密封，離心后上機檢測。數(shù)據(jù)分析采用美國Bio.Rad公司的Opticon Monitor Software 3.1版。根據(jù)標準品制作標準曲線，用ΔΔCt 值來統(tǒng)計比較不同實驗組目的基因的表達情況。

表1 ERβ及內(nèi)參β-actin的引物序列

三、統(tǒng)計學分析方法

采用SPSS 12.0軟件分析處理數(shù)據(jù)。細胞增殖、Ki67蛋白表達和細胞周期等數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較采用單因素方差分析。以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、不同時間點各組細胞增殖抑制率比較

培養(yǎng) 24、48、72 h的 CCK-8檢測結(jié)果顯示，各個作用時間段，LNCaP-AI細胞的存活率隨補骨脂素的濃度增加而明顯降低（P均＜ 0.01）。隨培養(yǎng)時間增加，各濃度組LNCaP-AI細胞的存活率亦明顯降低（P 均 ＜ 0.05）（表2）。

表2 補骨脂素干預后不同時間培養(yǎng)的LNCaP-AI細胞生存率的變化（n = 18，﹪，±s）

表2 補骨脂素干預后不同時間培養(yǎng)的LNCaP-AI細胞生存率的變化（n = 18，﹪，±s）

二、Western blot法檢測補骨脂素對LNCaP-AI細胞Ki67表達的影響

Western blot法檢測結(jié)果顯示，各濃度梯度的補骨脂素作用48 h后，LNCaP-AI細胞Ki67蛋白的表達均顯著低于對照組，且隨著補骨脂素濃度增高，Ki67蛋白表達量降低更明顯（27.82 ± 0.55 vs 25.27 ± 0.62 vs 23.93±0.50 vs 22.54±0.59，F(xiàn) =28.59，P ＜ 0.01）（圖1）。

圖1 不同濃度補骨脂素對LNCaP-AI細胞Ki67蛋白表達的影響

三、補骨脂素對LNCaP-AI細胞周期的影響

LNCaP-AI細胞與不同終濃度的補骨脂素共培養(yǎng)48 h后行流式細胞儀檢測細胞周期，結(jié)果顯示，隨著藥物濃度增高，G1期和G2期細胞均隨之增多，而S期細胞則隨之減少，差異均有統(tǒng)計學意義（F =38.26、216.63、153.58，P 均 ＜ 0.01）（圖2、表3）。提示補骨脂素將細胞阻滯于G1、G2期。

表3 流式細胞儀檢測不同濃度補骨脂素對LNCaP-AI細胞周期的影響（﹪，±s）

表3 流式細胞儀檢測不同濃度補骨脂素對LNCaP-AI細胞周期的影響（﹪，±s）

四、補骨脂素對LNCaP-AI細胞ERβ mRNA表達的影響

實時定量RT-PCR檢測結(jié)果顯示，終濃度分別為 30、50、100 μg/ml補骨脂素與 LNCaP-AI細胞共培養(yǎng)48 h后，隨著藥物濃度的增加，ERβ mRNA的表達量明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（1±0 vs 2.197±0.225 vs 4.573±0.346 vs 6.590 ±0.334，F(xiàn) =264.09，P ＜ 0.01）。

討 論

常用的前列腺癌細胞株包括LNCaP、PC3和DU145。其中PC3和DU145為發(fā)生前列腺外轉(zhuǎn)移的雄激素非依賴性細胞株[8]。LNCaP為雄激素依賴性，但經(jīng)過雄激素剝奪誘導培養(yǎng)后，可轉(zhuǎn)變?yōu)樾奂に胤且蕾囆?，即為LNCaP-AI，表現(xiàn)為在含普通血清的培養(yǎng)基及含去雄激素血清的培養(yǎng)基中的細胞活力無明顯差異[6-7]。LNCaP轉(zhuǎn)變?yōu)長NCaP-AI的過程，類似于臨床上前列腺癌經(jīng)過去勢治療后，由雄激素依賴轉(zhuǎn)變?yōu)镃RPC的過程。因此在涉及CRPC這種難治性前列腺癌的相關(guān)基礎(chǔ)研究中，LNCaP是一種理想的細胞模型。

圖2 流式細胞儀檢測不同濃度補骨脂素對LNCaP-AI細胞周期的影響

補骨脂素的抗腫瘤應(yīng)用是近年來的研究熱點之一。之前的研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂素能有效抑制雄激素依賴性LNCaP-AD細胞增殖，且該抑制作用呈明顯的濃度—時間關(guān)系[9]。本研究通過CCK-8檢測進一步發(fā)現(xiàn)，補骨脂素對LNCaP-AI也具有類似的細胞增殖抑制作用。本研究還檢測了補骨脂素對LNCaP-AI細胞Ki67表達的影響。Ki67是一種核抗原，在細胞的G0期不表達，只有在進入細胞周期（G1、S、G2和M）才表達，是反映腫瘤細胞增殖活性的標記物，其過量表達與多種惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移及預后相關(guān)[10-11]。本研究中，補骨脂素可降低LNCaPAI細胞中Ki67的表達水平，其作用呈濃度依賴性，與CCK-8檢測結(jié)果一致，進一步證實了補骨脂素對LNCaP-AI細胞的增殖抑制作用。由于臨床上CRPC的治療比雄激素依賴性前列腺癌治療棘手得多，因此本研究的結(jié)果相對更具有臨床意義。

細胞周期是指細胞從一次分裂完成到下一次分裂結(jié)束的全過程。細胞增殖周期的失控與惡性腫瘤的無限增殖密切相關(guān)，通過影響細胞周期抑制腫瘤細胞無限增殖是預防和治療腫瘤的一種方法。細胞周期調(diào)控機制中包含2個重要的調(diào)控點，分別位于G1/S期、G2/M期之間期[12]。既往的研究已發(fā)現(xiàn)，補骨脂素可對多種腫瘤細胞造成周期阻滯，但細胞不同，阻滯階段也不同[13]。本研究結(jié)果顯示，補骨脂素可對LNCaP-AI的細胞周期產(chǎn)生影響，隨著補骨脂素濃度的增加，位于G1、G2期的細胞百分比增加，提示補骨脂素對LNCaP-AI細胞周期的2個重要調(diào)控點均具有作用。

雌激素受體有ERα、ERβ兩種亞型，對前列腺癌的作用截然相反[14]。ERα可促進前列腺癌發(fā)生和發(fā)展，而ERβ則是一種抑癌基因，具有抑制增殖和腫瘤轉(zhuǎn)移的作用[14]。這方面的證據(jù)包括：ERβ表達較低的前列腺癌患者預后較差[15-16]、雷洛昔芬（一種ERβ激動劑）能明顯抑制前列腺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移[17]、三羥異黃酮可通過ERβ抑制前列腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移[18]。植物性雌激素與ERβ的親和力要比與ERα的親和力高10倍[19]。因此推測，作為一種植物雌激素，補骨脂素對LNCaP-AI細胞的作用可能與ERβ有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，補骨脂素在抑制LNCaP-AI細胞增殖的同時，可提高其ERβ的mRNA表達水平，提示補骨脂素對LNCaP-AI細胞的增殖抑制作用，可能通過ERβ而發(fā)揮作用。但補骨脂素是否激活ERβ，以及其促進ERβ mRNA表達的具體機制有待進一步研究。

本實驗表明，不同濃度的補骨脂素可抑制LNCaP-AI細胞的增殖，成劑量—時間依賴性關(guān)系，且降低LNCaP-AI細胞的Ki67表達水平。其可能的作用機制是誘導細胞發(fā)生G1期、G2期阻滯來實現(xiàn)，并與補骨脂素上調(diào)LNCaP-AI細胞ERβ的mRNA表達水平有關(guān)。

1 Ma L, Liu W, Sun F. Primary malignant melanoma of the prostate[J].Int J Urol, 2010, 17(1):94-95.

2 Zarour L, Alumkal J. Emerging therapies in castrate-resistant prostate cancer[J]. Curr Urol Rep, 2010, 11(3):152-158.

3 Li LC, Chui R, Nakajima K, et al. Frequent methylation of estrogen receptor in prostate cancer: correlation with tumor progression[J].Cancer Res, 2000, 60(3):702-706.

4 Hariri W, Sudha T, Bharali DJ, et al. Nano-targeted delivery of toremifene, an estrogen receptor-alpha blocker in prostate cancer[J].Pharm Res, 2015, 32(8):2764-2774.

5 Nelson AW, Tilley WD, Neal DE, et al. Estrogen receptor beta in prostate cancer: friend or foe?[J]. Endocr Relat Cancer, 2014,21(4):T219-234.

6 孔德玉, 楊冬梅, 陳艷媛. 雄激素非依賴性前列腺癌LNCaP-AI細胞亞系模型的建立[J]. 吉林醫(yī)藥學院學報, 2012, 33(6):361-363.

7 韓陽軍, 王冰, 蒙學冰. SATB1在人不同前列腺癌細胞系中表達的實驗研究[J]. 中國性科學, 2016, 25(6):5-8.

8 趙丕文, 牛建昭, 王繼峰, 等. 補骨脂素的植物雌激素作用及其機制探討[J]. 中國中藥雜志, 2008, 33(1):59-63.

9 Shi XB, Ma AH, Tepper CG, et a1. Molecular alterations associated with LNCaP cell progression to androgen independence[J]. Prostate,2004, 60(3):257-271.

10 陳書尚, 翁明芳, 王水良, 等. 補骨脂素對前列腺癌LNCap-AD細胞增殖的影響及其分子機制研究[J/CD]. 中華細胞與干細胞雜志(電子版), 2017, 7(4):219-223.

11 Petric M, Martinez S, Acevedo F, et a1. Correlation between Ki67 and histological grade in breast cancer patients treated with preoperative chemotherapy[J]. Asian Pac J Cancer Prey, 2014, 15(23):10277-10280.

12 Ji Y, Zheng M, Ye S, et a1. PTEN and Ki67 expression is associated with clinicopathologic features of non-small cell lung cancer[J]. J Biomed Res, 2014, 28(6):462-467.

13 管若男, 范蕾, 劉麗娟. TPh對肝癌細胞HepG-2細胞周期、凋亡及相關(guān)因子表達的影響[J]. 中國生化藥物雜志, 2017, 37(2):15-19.

14 趙萬忠, 程凱, 王曉紅, 等. 補骨脂素對乳腺癌耐藥細胞株周期和細胞凋亡的影響[J/CD]. 中華臨床醫(yī)師雜志(電子版), 2016(14):2111-2115.

15 Li LC, Chui R, Nakajima K, et al. Frequent methylation of estrogen receptor in prostate cancer: correlation with tumor progression[J].Cancer Res, 2000, 60(3):702-706.

16 Christoforou P, Christopoulos PF, Koutsilieris M. The role of estrogen receptor beta in prostate cancer[J]. Mol Med, 2014, 20:427-434.

17 Zellweger T, Sturm S, Rey S, et aI. Estrogen receptor beta expression and androgen receptor phosphorylation correlate with a poor clinical outcome in hormone-naive prostate cancer and are elevated in castration-resistant disease[J]. Endoe Re1at Caneer, 2013, 20(3):403-413.

18 Kim IY, Seo ND, Kim BC, et a1. Raloxifene, a selective astrogen receptor modulator，induces apoptosis in androgen-responsive human prostate cancer cell line LNCaP through an androgenindependent pathway[J]. Cancer Res, 2002, 62(13):3649-3653.

19 Pavese JM, Farmer RI, Bergan RC. Inhibition of cancer cell invasion and metastasis by genistein[J]. Cancer Metastasis Rev, 2010, 29(3):465-482.

20 Glazier MG, Bowman MA. A review of the evidence for the use of phytoestrogens as a replacement for traditional estrogen replacement therapy[J]. Arch Intern Med, 2001, 161(9):1161-1172.