神經(jīng)祖細(xì)胞與纖維蛋白支撐物移植對(duì)老年癡呆模型鼠的記憶認(rèn)知功能改善及其機(jī)理探究

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阿爾茨海默?。ˋlzheimer's disease，AD）是一種老年中樞神經(jīng)退行性疾病，其特征在于記憶、語(yǔ)言和認(rèn)知功能逐漸喪失。據(jù)估計(jì)，在美國(guó)超過(guò)3﹪ ～5﹪65歲以上的人患有AD，人數(shù)多達(dá)500 多萬(wàn)，全世界AD患者超過(guò)4 000萬(wàn)人[1-2]。在我國(guó)，已有大約900萬(wàn)人不同程度地患有AD。AD發(fā)生的主要病理改變是大腦海馬區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)Aβ和Tau組成的變性蛋白聚集體，從而引起神經(jīng)細(xì)胞的退行性改變[3]。目前沒(méi)有根治AD的藥物[4-6]，細(xì)胞治療為AD治療提供極大的臨床治療希望。

干細(xì)胞研究表明，發(fā)育中的大腦存在神經(jīng)發(fā)生，成人中樞神經(jīng)系統(tǒng)中也存在神經(jīng)祖細(xì)胞（neural progenitor cells，NPCs）[7-8]。因此，干細(xì)胞移植可修復(fù)受損的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，進(jìn)而治療神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病，特別是神經(jīng)變性疾病，比如AD[9]。移植的干細(xì)胞來(lái)源主要包括胚胎干細(xì)胞[10-11]，神經(jīng)干細(xì)胞[12-14]，成體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，成體臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞[15-18]和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞[19-24]等。在本實(shí)驗(yàn)中，用到的是免疫排斥小，效果好，易獲得的胎腦中的NPCs，通過(guò)加入提高細(xì)胞存活和加強(qiáng)細(xì)胞神經(jīng)分化的細(xì)胞因子，以研究其對(duì)老年癡呆模型鼠記憶認(rèn)知功能的改善及其機(jī)理的探究。Lu等[25]將多種生長(zhǎng)因子創(chuàng)新性的組合在一起加入到神經(jīng)干細(xì)胞中用于治療脊髓損傷模型大鼠，并取得了突破性研究。在本實(shí)驗(yàn)中，首次將多種生長(zhǎng)因子及纖維蛋白復(fù)合物組合在一起，并與NPCs移植入AD模型鼠中，以期觀察移植的NPCs在AD模型鼠腦內(nèi)的存活并向特定神經(jīng)元分化。

材料與方法

一、主要材料及試劑

1.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：實(shí)驗(yàn)性SPF級(jí)C57BL/6J雄鼠20 只，孕鼠10只，購(gòu)自濟(jì)南朋悅公司。SPF級(jí)APP/ PS1雙轉(zhuǎn)基因鼠50只，6到7月齡，購(gòu)自北京華阜康公司。

2.實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基、L-谷氨酰胺（L-Glutamine）、非必需氨基酸（non-essential amino acid、NEAA）、青霉素-鏈霉素（penicillin streptomycin，PS）、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（fibroblast growth factor，bFGF）、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）購(gòu)自 美 國(guó) Invitrogen公 司；腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）、膠質(zhì)細(xì)胞源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（glial cell-derived neurotrophic factor，GDNF）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子-3（neurotrophin-3，NT-3）、血小板衍生生長(zhǎng)因子（platelet derived growth factor，PDGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor，HGF）、類胰島素樣生長(zhǎng)因子（insulin-like growth factors-1，IGF-1）購(gòu)自美國(guó)Peprotech公司；MDL28170、纖維蛋白原（Fibrinogen）、凝血酶（Thrombin）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；一抗：抗MAP2抗體，抗Tuj1抗體，抗ChAT抗體及抗GFAP抗體；二抗：抗兔lgG Cy-3抗體及抗鼠lgG 488抗體均購(gòu)自美國(guó)Jackson ImmunoResearch公 司；Hoechst 33342購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；培養(yǎng)瓶、離心管、刻度吸管購(gòu)自美國(guó)Corning公司。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1. NPCs分離與培養(yǎng)：所有涉及到動(dòng)物模型的研究都經(jīng)聊城市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2014010）。取胎齡10 d的C57BL/6J孕鼠，斷頸處死，將鼠腦置于預(yù)冷PBS中，剝離腦膜，分離海馬區(qū)，機(jī)械法剪碎組織，然后加入脫氧核糖核酸酶Ⅰ工作液，用滴管吹打至單細(xì)胞懸液，400目濾網(wǎng)過(guò)濾，離心棄上清液，加入DMEM/F12洗滌1次，最后加入含 1 ﹪ PS、2 ﹪ B27、20 μg/L EGF 和 20 μg/ L bFGF的DMEM/F12完全培養(yǎng)基，將細(xì)胞接種于10 cm培養(yǎng)皿，于37 ℃，5 ﹪ CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

原代培養(yǎng)的NPCs在無(wú)血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)在前2 ～ 4 d時(shí)大部分死亡，到第7天左右，可發(fā)現(xiàn)由2 ～ 3個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，培養(yǎng)至第14天左右時(shí)，在每個(gè)培養(yǎng)皿中均可發(fā)現(xiàn)數(shù)十至上百個(gè)呈懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球。將包裝好的GFP慢病毒液（滴度1.0×108cfu/ml）加入到神經(jīng)球培養(yǎng)皿中，獲得帶有GFP熒光標(biāo)記的NPCs。

傳代的方法：用吸管將培養(yǎng)皿中的細(xì)胞懸液收集到15 ml的離心管中，400×g離心5 min，棄除上清，加入新鮮的NPCs培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打至大神經(jīng)球分散為小的神經(jīng)球或單個(gè)神經(jīng)細(xì)胞，按照1:3的比例傳代后繼續(xù)培養(yǎng)。

2. NPCs體外分化與免疫熒光染色：將細(xì)胞懸液400×g離心5 min棄上清，加入Accutase 37 ℃，消化10 min，然后用吸管輕輕吹打神經(jīng)球至單個(gè)細(xì)胞，將其接種到涂有poly-L-ornithine/Liminin的24 孔板中，細(xì)胞密度為5×104個(gè)/孔。NPCs體外分化培養(yǎng)基為含有1﹪雙抗、2﹪B27的DMEM/ F12培養(yǎng)基。

細(xì)胞分化3 d后，用4﹪多聚甲醛固定，磷酸鹽緩沖鹽水（PBS）洗滌，然后用含有10﹪正常山羊血清和0.1﹪Triton-X的PBS在室溫下孵育1 h，后將細(xì)胞與一抗 [MAP2，1:500 ；Tuj1，1:500 ；膽堿乙?；D(zhuǎn)位酶（choline acetyltransferase，ChAT），1:250和GFAP，1:250，均在4 ℃封閉溶液過(guò)夜?？雇胠gG Cy-3與抗鼠lgG 488分別用作二抗，在室溫孵育2 h。細(xì)胞核用DNA特異性熒光染料Hoechst 33342。

3.腦立體定位儀移植分離的NPCs：采用P4 ～P5代細(xì)胞，將細(xì)胞混懸液濃度調(diào)整為2.5×105個(gè)/μl，分為A、B兩管，各加入10種細(xì)胞因子（BDNF、VEGF、PDGF、HGF、EGF、bFGF、NT-3、GDNF、IGF-1及MDL28170），分別向A管中加入纖維蛋白原，B管中加入凝血酶（纖維蛋白原在凝血酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)槔w維蛋白，將移植的細(xì)胞固定在注射部位）。隨機(jī)將AD模型鼠分為3組，每組10只，分為NPCs+因子組、因子組及PBS組，利用腦立體定位儀向AD模型鼠兩側(cè)海馬位置（AP : 2.06，ML : 1.75，DV : 1.75）定向移植NPCs，一側(cè)孔分別注射管A 2 μl，管B 2 μl。其余各組相同方法處理。術(shù)后3 d密切注意小鼠飲食，健康狀況。

4. Morris水迷宮記憶行為檢測(cè)：Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)裝置由圓形水池、平臺(tái)、攝像系統(tǒng)以及動(dòng)物行為軌跡分析系統(tǒng)smart 3.0組成。水池直徑為120 cm，高50 cm。池壁上有N，E，S，W 4個(gè)等距離點(diǎn)，將水池分為NE，SE，SW，NW 4個(gè)區(qū)域。水迷宮實(shí)驗(yàn)過(guò)程分為連續(xù)5 d的定位巡航實(shí)驗(yàn)和第6天的空間探索實(shí)驗(yàn)兩部分。每天訓(xùn)練4次，每次使小鼠在不同區(qū)域下水，平臺(tái)即第5 區(qū)域，位于第4 區(qū)域內(nèi)。每次游泳時(shí)間60 s，每次訓(xùn)練間隔1 h左右。小鼠沒(méi)有找到平臺(tái)按60 s計(jì)算潛伏期。定位巡航實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠學(xué)習(xí)獲得能力，空間探索實(shí)驗(yàn)檢測(cè)小鼠空間記憶能力。用此方法對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組的AD模型鼠進(jìn)行行為檢測(cè)，對(duì)照組為未做任何處理的同月齡C57BL/6J小鼠。移植細(xì)胞1個(gè)月后，進(jìn)行行為測(cè)試，隨后每隔1個(gè)月進(jìn)行1次檢測(cè)，持續(xù)6個(gè)月。

5.新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)：訓(xùn)練時(shí)將2個(gè)相同的物體置于同一測(cè)試盒內(nèi)，讓被測(cè)試動(dòng)物在測(cè)試盒內(nèi)探求10 min。1 h后換掉其中1個(gè)物體（新物體在測(cè)試盒內(nèi)的位置保持不變），然后將被測(cè)試動(dòng)物再次置于測(cè)試盒內(nèi)，考察其能否識(shí)別出其中一個(gè)物體是新物體。如果動(dòng)物對(duì)已接觸過(guò)的物體有記憶，在測(cè)試的過(guò)程中它聞嗅新物體的時(shí)間占總聞嗅時(shí)間的百分比會(huì)明顯高于舊物體。50﹪代表小鼠對(duì)新舊物體的探究時(shí)間相同。

6.免疫組化：行為檢測(cè)結(jié)束后，將AD模型鼠麻醉灌流，取腦組織，在4﹪多聚甲醛中浸泡并固定24 h后，30﹪蔗糖溶液脫水24 ～ 48 h，然后包埋在Tissue-Tek OTC中并用低溫切片機(jī)切成20 μm的薄片。切片分別用NPCs增殖標(biāo)志分子BrdU抗體、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志分子GFAP抗體，膽堿能神經(jīng)元標(biāo)志分子ChAT抗體，4 ℃過(guò)夜孵育。PBS沖洗后，用熒光標(biāo)記的二抗Alexa Fluor 488或Cy3室溫孵育3 ～ 4 h，然后用細(xì)胞核抗體Hoechest33258孵育5 min。用熒光顯微鏡或激光掃描共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果。

7. Western blot：AD模型鼠麻醉生理鹽水灌流，取腦組織，分離海馬及皮層，移入EP管中，加入適量RIPA裂解液冰上裂解10 min；超聲破碎組織（50 Hz，1 min），500×g，4 ℃離心 15 min，吸取上清液；用BCA法定量測(cè)定蛋白濃度；將配制好的蛋白樣本于100 ℃恒溫加熱器上變性10 min 后冰上放置，進(jìn)行SDS-PAGE 蛋白電泳，半干轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，室溫封閉1 h，TBST 洗膜2 ～ 3次，每次 5 ～ 10 min；室溫孵育一抗 2 ～ 3 h 或者 4 ℃孵育過(guò)夜，回收抗體后，TBST洗3次，每次5 min；室溫孵育二抗1.5 ～ 2 h或者4 ℃孵育過(guò)夜，回收抗體后，TBST洗3次，每次5 ～ 10 min；ECL法顯色，拍照，保存數(shù)據(jù)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用GraphPad Pad 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物水迷宮逃避潛伏期、跨平臺(tái)次數(shù)結(jié)果采用±s表示，組間比較采用F檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、NPCs原代培養(yǎng)

胚胎來(lái)源呈懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球，胞體體積較大，胞漿顏色較深，胞核（胞漿）比例比較大，組成神經(jīng)球的細(xì)胞胞體大小基本一致，且每個(gè)神經(jīng)球的大小基本也一致，形態(tài)規(guī)則，無(wú)突起生長(zhǎng)，為典型的神經(jīng)球形態(tài)（圖1）。

圖1 倒置顯微鏡觀察原代培養(yǎng)的胎腦神經(jīng)祖細(xì)胞形成神經(jīng)球的過(guò)程（×100）

二、NPCs體外分化與免疫熒光染色

將神經(jīng)球取出，Accutase消化，用吸管輕輕吹打神經(jīng)球至其分散為單個(gè)細(xì)胞，將其接種到涂有poly-L-ornithine/Liminin的24孔板中。分化3 d后，細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)元細(xì)胞特異生物標(biāo)志物TUJ1與MAP2，及膽堿能神經(jīng)元細(xì)胞特異生物標(biāo)志物ChAT，部分細(xì)胞還表達(dá)星形膠質(zhì)細(xì)胞特異生物標(biāo)志物GFAP（圖2）。

三、記憶認(rèn)知功能檢測(cè)情況

1.水迷宮實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果：隨著連續(xù)5 d的訓(xùn)練，所有小鼠尋找平臺(tái)所需時(shí)間均有降低。于第5天，對(duì)實(shí)驗(yàn)組各組進(jìn)行定位巡航實(shí)驗(yàn)，得出各組逃避潛伏期結(jié)果（表1），結(jié)果顯示NPCs+因子組，以及因子組與PBS組比較，逃避潛伏期均有下降，表明兩組的AD模型鼠學(xué)習(xí)記憶能力均有改善（P ＜ 0.05）。24 h后，撤掉平臺(tái)，進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，得出各組跨平臺(tái)次數(shù)，NPCs+因子組、因子組與PBS組比較，都有升高，表明兩組實(shí)驗(yàn)鼠記憶保持能力也有提高（圖3）。

表1 AD模型鼠各組與WT組定位巡航實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期（s，±s）

表1 AD模型鼠各組與WT組定位巡航實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期（s，±s）

注：與 NPCs+因子組比較，aP ＜ 0.05；與因子組比較，bP ＜ 0.05；與對(duì)照組比較，cP ＜ 0.05

圖3 各實(shí)驗(yàn)組空間探索實(shí)驗(yàn)逃避潛伏期及跨平臺(tái)次數(shù)

連續(xù)進(jìn)行6個(gè)月水迷宮行為測(cè)試，得出各實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期時(shí)間變化曲線（圖4）。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，因子組實(shí)驗(yàn)鼠的記憶能力逐漸減弱，移植細(xì)胞組的記憶改善能力仍維持移植初水平，表明移植入的NPCs細(xì)胞在AD模型鼠腦內(nèi)存活，并對(duì)其記憶的改善能力發(fā)揮持續(xù)性效果。

圖4 不同時(shí)間各實(shí)驗(yàn)組逃避潛伏期變化

圖5 各實(shí)驗(yàn)組新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)測(cè)試結(jié)果：各實(shí)驗(yàn)組對(duì)新物體探究時(shí)間占總探究時(shí)間百分比結(jié)果中（圖5），NPCs+ 因子組為（68.46 ± 2.40）﹪，因子組為（65.20±1.03）﹪，PBS 組為（54.47 ± 4.79）﹪，野生對(duì)照組為（77.10 ± 4.02）﹪，其中NPCs+因子組高于PBS組（F = 3.983，P = 0.018），因子組同樣高于PBS組（F = 21.63，P = 0.042）。表明兩組小鼠對(duì)新物體識(shí)別記憶能力均得到改善。

四、免疫組化結(jié)果

將分離的NPCs與GFP熒光標(biāo)記共染后，注射到AD模型鼠海馬位置，行為檢測(cè)結(jié)束后處死取腦，得HE結(jié)果和免疫熒光結(jié)果（圖6）。ChAT熒光染色檢測(cè)各實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組小鼠腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)元分化情況（圖7）。

圖6 倒置熒光顯微鏡下觀察NPCs在AD模型鼠腦內(nèi)海馬部位存活情況（×200）

圖7 倒置熒光顯微鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組腦內(nèi)膽堿乙?；D(zhuǎn)位酶染色情況（×200）

五、Western blot結(jié)果

提取各實(shí)驗(yàn)組AD模型鼠及對(duì)照組老鼠腦內(nèi)海馬部位，進(jìn)行Western blot檢測(cè)，得出各實(shí)驗(yàn)組ChAT表達(dá)情況對(duì)比（圖8）。

討 論

在過(guò)去十年中，幾乎所有以針對(duì)β-淀粉樣蛋白（β-Amyloid）斑塊的藥物治療AD在臨床試驗(yàn)中都失敗了，表明需要采取新的方法來(lái)改善AD患者的學(xué)習(xí)和認(rèn)知功能。NPCs是能夠分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞從而來(lái)代替損傷的神經(jīng)細(xì)胞，并分泌神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)分子調(diào)節(jié)恢復(fù)AD患者的記憶和認(rèn)知功能。

分離了小鼠胎腦NPCs并聯(lián)合細(xì)胞因子共同移植到AD模型鼠中，發(fā)現(xiàn)能夠明顯改善AD小鼠的記憶認(rèn)知功能。免疫熒光及Western blot結(jié)果顯示，在移植NPCs的區(qū)域，即AD模型鼠海馬區(qū)，移植的NPCs不僅能夠長(zhǎng)時(shí)間存活，而且通過(guò)分化成了功能性的膽堿能神經(jīng)元來(lái)改善AD模型鼠的記憶認(rèn)知功能。表明NPCs能夠作為治療老年癡呆的潛在細(xì)胞來(lái)源。

此外，創(chuàng)新性的使用纖維蛋白支架（聯(lián)合使用纖維蛋白原與凝血酶）的方法保證了移植入AD模型鼠腦內(nèi)的NPCs和營(yíng)養(yǎng)因子成分能夠被固定在移植的海馬區(qū)域內(nèi)，發(fā)揮其特定功能。動(dòng)物行為檢測(cè)的結(jié)果也證明了AD模型鼠的認(rèn)知記憶功能得到明顯改善，而且這種改善能力可以持續(xù)4到6個(gè)月甚至更長(zhǎng)的時(shí)間。說(shuō)明了這種纖維蛋白支架對(duì)于NPCs的生長(zhǎng)分化存活有明顯支持作用，而且對(duì)AD模型鼠記憶功能改善的長(zhǎng)時(shí)間維持也有著十分明顯的效果。

NPCs與纖維蛋白支撐物聯(lián)合多種營(yíng)養(yǎng)因子移植明顯改善老年癡呆模型鼠的記憶認(rèn)知功能，該實(shí)驗(yàn)揭示了治療老年癡呆另一條更有效，更可行的治療途徑。而對(duì)于其改善記憶認(rèn)知功能的原理仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)探究。

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