自體骨髓間充質(zhì)干細胞對二甲基甲酰胺中毒肝衰竭患者肝功能恢復的促進作用

N，N-二甲基甲酰胺（N，N-dimethylfomamide DMF）是一種用途廣泛的化工原料和優(yōu)良溶劑，可用于有機合成、無機化工、合成纖維、人造革等多個行業(yè)。由于DMF為無色胺味液體，具有揮發(fā)性，作業(yè)場所DMF可經(jīng)皮膚和呼吸道吸收進入體內(nèi)，對肝臟、腎臟及肺等器官造成損害，尤其是對肝臟的毒性作用較大[1]，嚴重者可出現(xiàn)肝衰竭，甚至導致患者死亡[2-4]。目前DMF中毒者并無特效解毒藥，以保肝及對癥治療為主，人工肝為主的內(nèi)科綜合治療是這類患者最主要的治療手段，但人工肝治療僅能暫時和部分替代肝臟功能，難以起到促進肝再生，改善肝功能的作用。近年來，大量研究表明干細胞具有促進肝細胞再生和修復肝損傷的作用[5-6]，已有不少學者開展了骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs）治 療 肝衰 竭（失代償期）肝硬化臨床探索性研究，多數(shù)研究顯示BM-MSCs具有改善肝功能的作用。但主要集中在病毒和酒精所致的肝衰竭方面[7-8]，尚未見應用于化學中毒性肝損傷的報道。本研究對1例急性DMF中毒性急性肝衰竭后肝功能遲遲得不到改善的患者，在內(nèi)科綜合治療的基礎上聯(lián)合BM-MSCs肝動脈輸注治療，取得較好的效果，現(xiàn)結(jié)合文獻分析報道如下。

資料與方法

一、臨床資料

患者，男，36歲，已婚，以“腹脹、乏力伴皮膚、鞏膜黃染約14 d，意識障礙1 d”入院。15 d前患者因食欲減退、腹脹、乏力，皮膚、鞏膜黃染，就診于當?shù)蒯t(yī)院，化驗：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）589 U/L，谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）559 U/L，堿性磷酸酶（ALP）200 U/ L，總膽紅素（TBil）411 μmol/L，直 接 膽 紅素（Dbil）273.6 μmol/L，凝血酶原時間（PT）37 s，部分凝血活酶時間（APTT）70.1 s，纖維蛋白原（FIB）0.83 g/L。腹部彩超提示肝實質(zhì)回聲增粗增強。予以保肝、利膽、退黃、補充血漿和營養(yǎng)支持等治療效果不佳，且出現(xiàn)嗜睡、意識障礙，遂轉(zhuǎn)入我院進一步診斷治療。入院前在某皮革廠從事配料工作，有約2個月的“DMF”接觸史。既往無肝炎病史，無藥物暴露史、大量飲酒史、食物中毒史和過敏史，查體：生命體征平穩(wěn)，嗜睡，呼之可應，無法正確回答問題，查體欠配合。全身皮膚和鞏膜重度黃染，雙下肢、注射和穿刺部位可見瘀點、瘀斑，無肝掌和蜘蛛痣，心肺無異常，腹部飽滿，無壓痛、反跳痛，肝脾肋下未觸及，腹部移動性濁音陽性，雙下肢無明顯水腫。實驗室檢查：血細胞分析：白細胞（WBC）7.47×109/ L，NE 45.4﹪；肝功能：ALT 150 U/L，AST 187 U/L，ALP 93 U/L，TBil 356.0 μmol/ L，Dbil 118.3 μmol/L，血清白蛋白（ALB） 42g/L；凝血功能：PT 34.7 s，APTT 66.4 s；甲胎蛋白（AFP） 2.5 ng/ml，各種肝炎病毒檢測均陰性，巨細胞病毒、EB病毒DNA低于檢測下限，自身免疫性抗體及抗肝抗原均陰性。診斷急性重度DMF中毒，急性中毒性肝損傷，急性肝衰竭，肝性腦?。ˋ型2級）。

二、方法

（一）內(nèi)科綜合治療

入院后立即予食醋灌腸酸化腸道、靜脈注射門冬氨酸鳥氨酸（7.5 g、2/d）和復方支鏈氨基酸注射液（250 ml、1/d）治療肝性腦病，異甘草酸鎂（150 g、1/ d）、還原型谷胱甘肽（2.4 g、1/d）保護肝細胞，補充人血白蛋白、凍干凝血酶原復合物、凍干纖維蛋白原、冷沉淀等血制品改善凝血肝功，及人工肝輔助支持治療。

患者入院后黃疸持續(xù)升高，ALT、AST下降，出現(xiàn)“膽酶分離”現(xiàn)象，凝血酶原活動度（PTA）下降至10﹪左右。在人工肝為主（每2 ～ 3 d 1次）的內(nèi)科綜合治療3周后，患者病情進展得到控制，肝性腦病好轉(zhuǎn)。但隨后患者的肝功恢復十分緩慢，從第3周到第8周，1個多月的時間內(nèi)肝功無明顯好轉(zhuǎn)，反映肝臟合成功能的指標（PTA、ALB、CHOL）遲遲得不到改善，繼續(xù)大量補充白蛋白、血漿、凝血因子等血制品，PTA一直在40﹪以下波動，TBil仍在正常檢測值上限的5倍左右，肝功能持續(xù)處于失代償狀態(tài)，8周時評估Child-Pugh分級仍為C級，終末期肝病模型評分21分?？紤]到患者存在大塊或亞大塊肝細胞壞死，有功能的肝細胞和肝小葉不足，肝功能恢復較困難。經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，與患者簽署知情同意書后，入院后第8周為患者進行了自體BMMSCs經(jīng)肝動脈肝內(nèi)移植治療。

（二）BM-MSCs移植治療

BM-MSCs制備：在無菌條件下，局麻從髂骨抽取患者骨髓血15 ～ 20 ml, 在A/B級層流實驗室按1 : 1比例加入到含有骨髓稀釋液的無菌離心管中，震蕩混勻。用無菌注射器吸取淋巴細胞分離液，將其鋪設于待分離的骨髓液下方，4 ℃條件下250×g，離心30 min（注意將離心機的剎車裝置關閉），用無菌注射器吸取分離液與骨髓液之間的淡黃色液層（單個核細胞層），將收集到的單個核細胞按1 : 1比例與骨髓稀釋液混合，4 ℃條件下250×g，離心15 min，棄上清后用骨髓稀釋液重新懸浮沉積到試管底部的骨髓細胞，接種于250 ml培養(yǎng)瓶，置于體積分數(shù)為5﹪CO2飽和濕度的37 ℃恒溫孵育箱中培養(yǎng)，約10 d左右細胞生長融合，收集細胞制備成骨髓懸液，活細胞計數(shù)，細胞數(shù)量1×107個/ ml。流式細胞儀鑒定顯示 CD29+、CD44+、CD90+、CD34-、CD45-，符合國際細胞治療學會間充質(zhì)及組織干細胞委員會提出的BM-MSCs鑒定標準[9]。

BM-MSCs輸注：在數(shù)字減影血管造影（DSA）下股動脈穿刺插管，造影顯示肝固有動脈，將50 ml（BM-MSCs濃度為5.0×106個/kg）制備成的BMMSCs緩慢注入肝動脈，20 ml生理鹽水沖管。術畢穿刺點加壓包扎返回病房，穿刺側(cè)下肢制動6 h。

結(jié) 果

一、肝功恢復情況

采取BM-MSCs移植治療后，肝功能恢復加速，BM-MSCs治療10 d后復查TBil較移植前下降了50﹪，PTA逐漸恢復到40﹪以上，術后4周ALB開始緩慢升高（圖1），8周肝功能評估Child-Pugh分級A級（6分），MELD評分7分。

圖1 患者肝功及凝血功能變化曲線

二、影像學變化

與3周時上腹部CT掃描（圖2a）比較，BMMSCs輸注后4周上腹部CT提示腹水消失，肝臟體積較前略有增大，肝左右葉比例失調(diào)，肝臟再生結(jié)節(jié)進一步增大，增強掃描動脈期結(jié)節(jié)強化較均勻，考慮再生結(jié)節(jié)以動脈供血為主，且血流豐富（圖2b）。

三、病理改變

干細胞移植后8周在彩超引導下對再生結(jié)節(jié)行穿刺活檢，鏡檢（圖3）：肝組織病變不均勻，部分肝組織呈炎癥病理改變（G3，S2，F(xiàn)1），肝細胞腫脹，少量氣球樣變，少量點狀/灶性壞死，局部橋接壞死，輕度小泡性脂肪變性；部分肝組織呈慢性肝纖維化病理改變，肝細胞大塊狀壞死，被纖維組織取代，其間有細膽管增生和膽管內(nèi)小膽栓形成，以及再生的肝細胞島。

四、安全性及遠期隨訪

患者在BM-MSCs移植術中及術后均未出現(xiàn)明顯與干細胞治療相關的不良反應。患者出院后每3個月復查一次，臨床癥狀完全消失，可從事輕體力工作，生化提示ALP、GGT輕度升高，其余肝功能指標均正常，Child-Pugh分級保持在A級。影像學檢查增強MRI上可見肝臟體積仍較小，肝葉比例失調(diào)，可見圓形結(jié)節(jié)形成，T1WI上高信號，T2WI上低信號，較前增大，逐漸充滿整個肝右葉，DWI上未見信號增高，結(jié)節(jié)間纖維間隔粗細不均，肝臟再生結(jié)節(jié)隨訪3年未發(fā)生惡變（圖2c、d）。

討 論

DMF是公認已知的肝毒性化學藥物，廣泛應用于人造革行業(yè)，在常溫下可揮發(fā)，即使是在佩戴手套和口罩的情況下作業(yè)，也可經(jīng)皮經(jīng)呼吸道吸收[10]，因此在炎熱的夏天，高溫、高濕條件下暴露DMF后，中毒的發(fā)生率較高[11]。DMF的中毒性機制尚未完全闡明，目前認為與其在體內(nèi)的代謝過程及代謝產(chǎn)物異氰酸甲酯（MIC）相關[12-13]，MIC具有親電活性，通過與蛋白質(zhì)、核酸等細胞大分子物質(zhì)共價結(jié)合造成細胞損傷，同時可與谷胱甘肽（GSH）結(jié)合生成S-（N一甲基氨基甲酰）谷胱甘肽（SMG），使內(nèi)源性SMG減少，導致體內(nèi)自由基清除減弱，自由基的增多加重細胞的損傷。Twiner等[14]研究還發(fā)現(xiàn)DMF可影響細胞內(nèi)的pH值，抑制肝細胞的增殖、分化，影響肝細胞的再生。

圖2 肝衰竭患者BM-MSCs移植前后肝臟影像學改變

BM-MSCs是骨髓中存在的一種具有自我更新和多向分化潛能的干細胞，體外擴增后移植入體內(nèi)可分化為肝細胞[15]，替代正常肝臟所需的合成和代謝功能，更重要的是可通過旁分泌途徑改變組織微環(huán)境，促進內(nèi)源性細胞增殖和血管增生[6]，調(diào)節(jié)免疫反應減輕肝臟的炎癥反應[16]，調(diào)控肝星狀細胞改善肝纖維化[17]。將BM-MSCs移植應用于DMF中毒性肝衰竭患者的救治，移植入體內(nèi)的BM-MSCs不僅可以通過旁分泌機制穩(wěn)定肝細胞再生、增值的內(nèi)環(huán)境，還可分化為肝細胞、膽管上皮細胞等進一步改善肝功能。

本例DMF所致嚴重肝衰竭患者急性期病情得到控制后，肝功能遲遲得不到恢復，影像學提示肝臟明顯縮小，雖然能夠看到再生結(jié)節(jié)，但是大塊及亞大塊肝壞死致使肝臟有效體積仍嚴重不足，因此，肝細胞壞死得到控制后，肝功能不全的表現(xiàn)持續(xù)得不到改善情況下，應用干細胞治療后，患者肝功能不全的臨床表現(xiàn)和實驗室指標快速恢復，Child-Pugh分級由C級轉(zhuǎn)為A級，終末期肝病模型評分由21 分降到7分，TBIL、PTA、ALB等主要肝功生化的變化規(guī)律與Peng等[7]的研究相一致。上述改變是在停止人工肝和其他內(nèi)科綜合治療措施不變的情況下出現(xiàn)的，雖然不排除隨著發(fā)病時間的延長肝功能自然恢復的存在，但從干細胞治療后的肝功能變化的時間節(jié)點上仍可以判定BM-MSCs移植在肝功能恢復中發(fā)揮了重要作用。

有文獻報道干細胞移植可能存在潛在的致癌性，間充質(zhì)干細胞在體外連續(xù)傳代培養(yǎng)后，可出現(xiàn)染色體畸變，惡性轉(zhuǎn)化[18]；還可通過自分泌（旁分泌）途徑改變腫瘤細胞微環(huán)境，促進腫瘤細胞的生長，刺激腫瘤細胞遷移和侵襲[19]。本例DMF中毒性肝衰竭經(jīng)BM-MSCs治療后，未出現(xiàn)相關的不良反應，腹部CT提示肝內(nèi)再生結(jié)節(jié)增大，為排除惡變可能，行肝穿刺活檢，病理提示肝組織病變不均勻，呈多形性損傷。光鏡下肝組織表現(xiàn)為慢性炎癥，部分肝組織呈局灶性肝纖維化，符合化學藥物中毒引起區(qū)域性亞大塊肝壞死的特殊病理表現(xiàn)[20-21]，其間有成簇的再生肝細胞島，考慮為特異性DMF中毒肝細胞島[22]，未見異形或癌變細胞。出院后每3 ～ 4個月復查肝臟影像學檢查，隨訪至今已達3年余，肝內(nèi)結(jié)節(jié)無明顯增大，尚未觀察到干細胞移植后肝臟癌變跡象。

圖3 肝衰竭患者BM-MSCs移植后肝穿刺活檢病理特點

本文探索性地將BM-MSCs應用于化工毒物DMF中毒性所致肝衰竭肝功延遲恢復的患者的治療，取得了明顯的療效，提示BM-MSCs對DMF中毒肝衰竭患者肝功恢復具有一定的促進作用。但本文僅對1例患者進行研究和觀察，其確切療效有待于進一步擴大樣本量和動物實驗研究證實。

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