ICU患者艱難梭菌分離培養(yǎng)與流行病學(xué)特征研究

曾勇彬，劉安超，李武，唐堯，賴毅真，葉思琪，林曉，林建東，林宇嵐，楊濱

1.福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 福州 350005；2.福建醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)與工程學(xué)院，福建 福州 350005

艱難梭菌(Clostridiumdifficile，CD)是一種革蘭陽性、專性厭氧的粗大芽孢桿菌，于1935年由Hall和O′Toole首次從健康新生兒糞便中分離[1]。艱難梭菌分布廣泛，可在健康人胃腸道定植，是一種條件致病菌，經(jīng)糞-口傳播，也是院內(nèi)獲得性腸道感染及抗生素相關(guān)性腹瀉(antibiotic associated diarrhea，AAD)的主要病原菌。艱難梭菌包括產(chǎn)毒株和非產(chǎn)毒株兩種：非產(chǎn)毒株無致病性；產(chǎn)毒株可產(chǎn)生A、B兩種主要的致病毒素(分別由tcdA和tcdB基因編碼)，少數(shù)可產(chǎn)生二元毒素[2-3]。

當(dāng)腸道微生態(tài)平衡遭到破壞(如濫用/長期使用抗生素、免疫抑制劑、質(zhì)子泵抑制劑、化療藥物等)時(shí)，腸道正常菌群受到抑制，艱難梭菌大量生長，可造成艱難梭菌感染(Clostridiumdifficileinfection，CDI)和艱難梭菌相關(guān)性腹瀉(Clostridiumdifficileassociated diarrhea，CDAD)，輕者表現(xiàn)為自限性腹瀉，重者可出現(xiàn)偽膜性腸炎，中毒性巨結(jié)腸，甚至死亡[4]。近幾年來，全球范圍內(nèi)CDI的發(fā)生率和病死率日益增加，在歐洲和北美已有多次暴發(fā)流行，引起世界各國的廣泛關(guān)注，預(yù)防艱難梭菌感染顯然成為醫(yī)院感染控制的新挑戰(zhàn)[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，CDI的高危因素包括廣譜抗生素的使用、老齡、長時(shí)間住院、免疫系統(tǒng)缺陷、化學(xué)治療、嚴(yán)重的基礎(chǔ)疾病、應(yīng)用質(zhì)子泵抑制劑、應(yīng)用H2受體抑制劑和應(yīng)用糖皮質(zhì)激素等[5-6]。ICU患者由于病情比較危重、基礎(chǔ)疾病相對較多，部分病人需聯(lián)合應(yīng)用抗生素以及有可能長期住院，極有可能增加CDI的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，甚至暴發(fā)流行，這對ICU患者來說可能是致命的[7]。本研究針對我院ICU住院時(shí)間>7 d的患者，調(diào)查艱難梭菌定植/感染情況，為了解艱難梭菌的流行情況，開展艱難梭菌的治療和控制提供參考。

1 對象與方法

1.1標(biāo)本收集 選擇2016年9月至2017年6月福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院ICU住院時(shí)間>7 d的139例患者為研究對象，收集糞便樣本，采集患者新鮮糞便3～5 g(若是液狀糞便，采集2～3 mL)，裝于清潔的不含防腐劑的糞便采集管中。

1.2臨床資料收集 通過查閱病歷系統(tǒng)收集臨床資料，包括患者年齡、性別、入院時(shí)間、臨床診斷、所用抗生素類型、所用抗生素的先后順序、所用抗生素的持續(xù)時(shí)間、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)、C-反應(yīng)蛋白(CRP)、降鈣素原(PCT)等以及質(zhì)子泵抑制劑(PPI)、組胺受體抑制劑、激素等藥物使用情況。艱難梭菌定植(Clostridiumdifficilecolonization，CDC)是指艱難梭菌培養(yǎng)陽性，但患者未出現(xiàn)腹瀉癥狀；艱難梭菌感染(CDI)定義為患者出現(xiàn)腹瀉同時(shí)產(chǎn)毒艱難梭菌培養(yǎng)陽性；腹瀉定義為24 h內(nèi)出現(xiàn)3次以上不成形便。

1.3試劑與儀器 ABI梯度PCR儀(VeritiTM96，美國Life Technologies公司)、臺式離心機(jī)(德國Eppendorf公司)、電子天平(德國Sartorius公司)、DYY-7C型電泳儀(北京六一儀器廠)、NanoDrop 2000微量紫外分光光度計(jì)(美國Thermo Fisher 公司)、GENbag厭氧產(chǎn)氣袋和艱難梭菌鑒定平板(法國生物梅里埃公司)、布魯克MALDI Biotyper質(zhì)譜儀(美國布魯克 道爾頓公司)、2×PCR MasterMix(大連寶生物工程有限公司)、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化有限公司)、艱難梭菌毒素A & B檢測試劑盒(美國TechLab公司)。

1.4厭氧培養(yǎng)與質(zhì)譜鑒定 取適量糞便標(biāo)本與等體積無水乙醇振蕩混勻，室溫靜置60 min，3 000 r/min離心5 min，棄上清，將沉淀物分區(qū)劃線接種于艱難梭菌選擇性培養(yǎng)基CDIF(法國生物梅里埃公司)，35℃厭氧培養(yǎng)48 h。艱難梭菌在CDIF培養(yǎng)基上生長呈黑色菌落。挑取典型菌落2～3個(gè)/平板，使用布魯克MALDI Biotyper質(zhì)譜儀進(jìn)行可疑艱難梭菌的鑒定。質(zhì)譜儀線性正性模式頻率為60 Hz，采集分子量為2 000～20 000的蛋白質(zhì)圖譜。每一個(gè)樣本的蛋白質(zhì)譜在不同位置經(jīng)過200次的激光點(diǎn)擊而獲得，采集到的特征性蛋白質(zhì)峰信息通過軟件校正，然后與儀器內(nèi)的微生物數(shù)據(jù)庫圖譜進(jìn)行比對分析，最終獲得鑒定結(jié)果。

1.5艱難梭菌毒素A & B表型檢測 采用艱難梭菌毒素A&B檢測試劑盒(美國TechLab公司)對質(zhì)譜儀鑒定的陽性菌株進(jìn)行毒素表型檢測。

1.6艱難梭菌毒素基因檢測 采用細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒提取艱難梭菌DNA。用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)毒素基因擴(kuò)增引物(包括tcdA、tcdB、cdtA、cdtB，見表1)。PCR反應(yīng)體系25 μL，包括2×PCR MasterMix 12.5 μL、上下游引物各0.7 μL、細(xì)菌模板2.0 μL、ddH2O 9.1 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃ 3 min；94℃ 30 s、58℃ 30 s、72℃ 45 s，共40個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min。取10 μL PCR產(chǎn)物，在2.0%瓊脂糖凝膠上電泳(120 V、90 mA、45 min)，觀察結(jié)果。

表1 艱難梭菌毒素基因PCR引物序列

2 結(jié) 果

2.1ICU艱難梭菌定植與非定植患者相關(guān)因素比較 由表2可見，高齡、長時(shí)間住院、高淋巴細(xì)胞數(shù)、使用β-內(nèi)酰胺類抗生素是艱難梭菌定值的高危因素。

2.2ICU患者艱難梭菌定植危險(xiǎn)因素分析 Logistic多因素分析結(jié)果顯示，使用β-內(nèi)酰胺類藥物為ICU患者發(fā)生艱難梭菌定植的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(OR=3.881，P=0.039)，見表3。

2.3艱難梭菌菌落形態(tài)與典型質(zhì)譜峰圖 如圖1A所示，艱難梭菌在CDIF顯色培養(yǎng)基上生長呈典型的黑色菌落。艱難梭菌的特征性蛋白質(zhì)質(zhì)譜圖見圖1B，其質(zhì)荷比分布為2 000～12 000；峰的相對強(qiáng)度為(0.1～1.9)×104。

表2 ICU艱難梭菌定植和非定植患者相關(guān)因素比較

表3 ICU患者艱難梭菌定植危險(xiǎn)因素的Logistic分析

A：艱難梭菌在CDIF培養(yǎng)基上呈典型的黑色菌落(黑色箭頭所指)；B：標(biāo)準(zhǔn)條件下艱難梭菌特征質(zhì)譜圖(橫坐標(biāo)為質(zhì)荷比，縱坐標(biāo)為峰相對強(qiáng)度)

圖1艱難梭菌在CDIF培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)和特征性質(zhì)譜峰圖

2.4分子流行病學(xué)特征

2.4.1艱難梭菌毒素A&B表型檢測 共檢出24株艱難梭菌，其中僅有1株為A&B毒素表型陽性，占4.2%，其余23株均未檢出A&B毒素，占95.8%。

2.4.2艱難梭菌毒素基因檢測 24株艱難梭菌中，14株艱難梭菌的tcdA和tcdB基因檢測陽性，占58.3%；有10株為tcdA/tcdB基因檢測陰性，占41.7%；所有菌株二元毒素基因(ctdA/ctdB)均未檢出。見圖2。

注：泳道1為DNA標(biāo)準(zhǔn)條帶；泳道2、3、4、5、6為tcdA；泳道7、8、9、10、11為tcdB。

圖2艱難梭菌毒素A和毒素B基因PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果

3 討 論

3.1艱難梭菌感染的現(xiàn)狀 隨著廣譜抗生素的大量使用、人口老齡化的加速、住院時(shí)間的延長，艱難梭菌感染已成為住院患者特別是高風(fēng)險(xiǎn)科室(如ICU、腫瘤內(nèi)科、血液科等)醫(yī)院感染的主要病原體。加拿大、美國以及歐洲一些國家已經(jīng)多次出現(xiàn)艱難梭菌感染的暴發(fā)流行，引起全球的廣泛關(guān)注[3]。2010年美國醫(yī)療保健流行病學(xué)學(xué)會/美國感染病學(xué)會(SHEA/IDSA)、2009年和2013年歐洲臨床微生物與感染性疾病學(xué)會(ESCMID)、2013年美國胃腸病學(xué)會(ACG)均發(fā)表了CDI的診療指南[8-11]。

3.2艱難梭菌感染的國內(nèi)外研究情況 報(bào)道顯示，艱難梭菌感染在我國部分地區(qū)呈較高水平[12]。高姍等[13]在128例醫(yī)院高風(fēng)險(xiǎn)科室的住院患者中，發(fā)現(xiàn)艱難梭菌糞便培養(yǎng)的陽性率為17.19%，毒素陽性率為16.41%?？总驳萚14]對江蘇地區(qū)兩所不同規(guī)模醫(yī)院的高危人群進(jìn)行艱難梭菌篩查發(fā)現(xiàn)，122例患者中共檢出艱難梭菌38株，其中毒素陽性率為20.49%。韓曉紅等[15]報(bào)道惡性腫瘤患者艱難梭菌陽性率為14.8%。國外的研究也顯示，住院和長期住院患者艱難梭菌的定植率可高達(dá)30%～50%[16]。本研究結(jié)果提示，我院ICU科室存在著艱難梭菌流行的風(fēng)險(xiǎn)，尤其是長時(shí)間住院、高年齡、高淋巴細(xì)胞數(shù)的患者。本研究發(fā)現(xiàn)我院ICU患者艱難梭菌定植率為17.27%，與報(bào)道有所差異，這可能與地域差異、研究人群不同有關(guān)[3]。通過艱難梭菌定植的單因素分析，我們發(fā)現(xiàn)年齡可能與艱難梭菌定植有關(guān)，其原因可能與老年人患者基礎(chǔ)性疾病比較多，免疫功能較差有關(guān)。另外也與ICU患者住院時(shí)間較長(長期住院，患者接觸CD芽孢的機(jī)會大)，使用抗生素種類多(多種抗生素應(yīng)用更易發(fā)生菌群失調(diào))有關(guān)。研究表明，使用第三代頭孢菌素、喹諾酮類、碳青霉烯類和β-內(nèi)酰胺酶抑制劑會顯著增加CDI發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[5]。本研究提示，長期使用β-內(nèi)酰胺類抗生素可增加艱難梭菌感染的風(fēng)險(xiǎn)，這可能與抗生素使用易引起腸道菌群失調(diào)有關(guān)。本研究顯示，β-內(nèi)酰胺類抗生素的使用在艱難梭菌定植的發(fā)生過程中起了重要作用，是艱難梭菌定植發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。值得注意的是，本研究還發(fā)現(xiàn)淋巴細(xì)胞數(shù)與艱難梭菌的定值有關(guān)，高淋巴細(xì)胞數(shù)患者艱難梭菌更容易定值，其發(fā)生機(jī)制尚待進(jìn)一步探索。

3.3ICU艱難梭菌分子流行情況 由tcdA、tcdB基因編碼的毒素A和毒素B是艱難梭菌產(chǎn)毒株中最常見的兩種外毒素[3]。毒素A是一種腸毒素，可引起黏膜炎癥和細(xì)胞浸潤；毒素B是一種細(xì)胞毒素，其毒性比毒素A強(qiáng)100～1 000倍，可使細(xì)胞發(fā)生凋亡、變性、壞死、脫落。絕大多數(shù)菌株可同時(shí)產(chǎn)生毒素A和B，但最近越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，有的菌株只產(chǎn)生毒素B，而不產(chǎn)生毒素A[2-3]。本研究中有14株艱難梭菌tcdA和tcdB基因檢測陽性，占總分離株的58.3%，而二元毒素基因(ctdA/ctdB)均未檢出，與亞洲各國文獻(xiàn)報(bào)道較為一致。

3.4本研究的臨床意義 艱難梭菌可引起交叉感染，其傳染源包括患者、治療好轉(zhuǎn)的患者、被污染的醫(yī)療器械、物品及醫(yī)護(hù)人員的手等。在當(dāng)前CDI日趨增加的形勢下，我們有必要做好ICU科室的主動預(yù)防監(jiān)測工作，對CDI患者進(jìn)行隔離，消除其播散隱患，慎用抗菌藥物，密切關(guān)注長時(shí)間住院、長期使用抗生素等艱難梭菌感染高危因素的患者；加強(qiáng)環(huán)境清潔消毒(包括醫(yī)護(hù)人員的手、臺面、床等等)工作，降低艱難梭菌芽孢傳播的風(fēng)險(xiǎn)，防止艱難梭菌感染的暴發(fā)、流行。

[1] Lawson PA, Citron DM, Tyrrell KL, et al. Reclassification ofClostridiumdifficileasClostridioidesdifficile(Hall and O′Toole 1935)Prévot 1938[J]. Anaerobe, 2016, 40(8): 95-99.

[2]McConnie R, Kastl A.Clostridiumdifficile, colitis, and colonoscopy: Pediatric perspective[J]. Current Gastroenterol Reports, 2017, 19(8): 34.

[3]Wang R, Chen HX, Song LJ, et al. Molecular epidemiology and antimicrobial susceptibility ofClostridiumdifficileisolated from the Chinese People′s Liberation Army General Hospital in China[J]. Int J Infect Dis, 2018, 67(2): 86-91.

[4]To KB, Napolitano LM.Clostridiumdifficileinfection: Update on diagnosis, epidemiology, and treatment strategies[J]. Surg Infect, 2014, 15(5): 490-502.

[5]Zacharioudakis IM, Zervou FN, Pliakos EE, et al. Colonization with toxinogenicC.difficileupon hospital admission, and risk of infection: A systematic review and meta-analysis[J]. Am J Gastroenterol, 2015, 110(3): 381-390.

[6]Loo VG, Bourgault AM, Poirier L, et al. Host and pathogen factors forClostridiumdifficileinfection and colonization[J]. N Engl J Med, 2011, 365(18): 1693-1703.

[7]Lee JC, Hung YP, Lin HJ, et al.Clostridiumdifficileinfections in medical intensive care units of a medical center in Southern Taiwan: Variable seasonality and disease severity[J]. PLoS One, 2016, 11(8): e0160760.

[8]Cohen SH, Gerding DN, Johnson S, et al. Clinical practice guidelines forClostridiumdifficileinfection in adults: 2010 update by the society for healthcare epidemiology of America(SHEA) and the infectious diseases society of America(IDSA)[J]. Infect Control & Hosp Epidemiol, 2010, 31(5): 431-455.

[9]Crobach MJ, Dekkers OM, Wilcox MH, et al. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases (ESCMID): Data review and recommendations for diagnosingClostridiumdifficile-infection(CDI)[J]. Clin Microbiol & Infect, 2009, 15(12): 1053-1066.

[10] Debast SB, Bauer MP, Kuijper EJ. European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases: Update of the treatment guidance document forClostridiumdifficileinfection[J]. Clin Microbiol & Infect, 2014, 20(Suppl 2): 1-26.

[11] Surawicz CM, Brandt LJ, Binion DG, et al. Guidelines for diagnosis, treatment, and prevention ofClostridiumdifficileinfections[J]. Am J Gastroenterol, 2013, 108(4): 478-498.

[12] Cheng JW, Yang QW, Xiao M, et al. High in vitro activity of fidaxomicin againstClostridiumdifficileisolates from a university teaching hospital in China[J]. J Microbiol Immunol Infec, 2017, doi: 10.1016/j.jmii.2017.06.007.

[13] GAO Shan, JIN Hui, LI Fuqin, et al. Prevalence ofClostridiumdifficileinfection in high risk departments[J]. Chin J Nosocomiol, 2015(11): 2423-2425. (in Chinese)

高姍, 金慧, 李福琴, 等. 艱難梭菌在高風(fēng)險(xiǎn)科室醫(yī)院感染流行趨勢研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2015(11): 2423-2425. (in Chinese)

[14] KONG Yi, JIN Hui, JIANG Yihong, et al. Epidemiology ofClostridiumdifficileinfection in hospitals in Jiangsu[J]. Chin J Nosocomiol, 2016, 26(11): 2421-2424. (in Chinese)

孔懿, 金慧, 姜亦虹, 等. 江蘇地區(qū)醫(yī)院艱難梭菌流行病學(xué)研究[J]. 中華醫(yī)院感染學(xué)雜志, 2016, 26(11): 2421-2424.

[15] ZHU Yu, WANG Li, FENG Shana, et al. Risk factors forClostridiumdifficile-associated diarrhea among cancer patients[J]. Chin J Oncol, 2014, 36(10): 773-777. (in Chinese)

朱宇, 王力, 馮莎娜, 等. 惡性腫瘤患者艱難梭菌相關(guān)性腹瀉的臨床危險(xiǎn)因素分析[J]. 中華腫瘤雜志, 2014, 36(10): 773-777.

[16] Elliott B, Chang BJ, Golledge CL, et al.Clostridiumdifficile-associated diarrhoea[J]. Int Med J, 2007, 37(8): 561-568.