氯離子通道CFTR在肝臟慢性炎癥中的作用

張國福，潘寧，石海紅，馬淑霞，王春敏，崔剛，侯霞

1.佳木斯大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007； 2.佳木斯市傳染病院 檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154007； 3.佳木斯大學(xué)第一附屬醫(yī)院 物理診斷科，黑龍江 佳木斯 154002

囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)因子(cystic fibrosis transmembrane conductance regulator，CFTR)是一種由cAMP激活的氯離子通道。CFTR蛋白廣泛分布于人體各個(gè)具有分泌功能的組織中，如消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)和生殖系統(tǒng)等[1]。當(dāng)該基因突變導(dǎo)致功能異?；驕p少時(shí)，細(xì)胞將無法進(jìn)行正常的分泌活動(dòng)，導(dǎo)致水鹽代謝失衡，水分流失，分泌物粘稠，從而引起局部組織大分子分泌物聚集和慢性感染[2]。囊性纖維化(cystic fibrosis，CF)是由CFTR突變引起一種常染色體隱形遺傳病，約有65.2% CF患者會(huì)出現(xiàn)肝臟慢性炎癥，說明CFTR表達(dá)變化與炎癥發(fā)生密切相關(guān)[3-4]。肝臟在調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)平衡中具有重要作用，肝臟炎癥的發(fā)生會(huì)破壞兩者之間的相互調(diào)控。在本研究中，我們利用CFTR敲除小鼠的肝組織，對(duì)炎癥信號(hào)通路進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)JNK(c-Jun N-terminal kinase，c-Jun氨基末端激酶)、AKT(絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶)等炎癥相關(guān)的因子表達(dá)水平發(fā)生顯著變化，所以CFTR很可能具有抗炎因子的作用。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6純系小鼠野生型和CFTR-/-基因敲除小鼠，2月齡，由美國匹茲堡大學(xué)R.J.Frizzell教授實(shí)驗(yàn)室贈(zèng)送。CFTR217抗體購自北卡羅林納大學(xué)，P-JNK(sc-293136)、JNK(sc-571)、P-AKT(sc-135650)和AKT(sc-24500)抗體均為Santa Cruz產(chǎn)品，HRP標(biāo)記的羊抗大鼠二抗(ab6741，Abcam)。Renaissance Chemiluminescence ECL發(fā)光底物試劑盒(NEN life Science產(chǎn)品)，X光膠片購自柯達(dá)(XOMAT BT)。

1.2方法

1.2.1組織蛋白提取 將小鼠斷髓法處死后，迅速取出肝臟，剪下膽囊下側(cè)肝組織，迅速投入RIPA裂解液[150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tri-HCl(pH 7.4)，1 mM EDTA，0.1% SDS，1% deoxycholic acid，1% Triton X-100，1 mmol/L PMSF，5 μg/mL Aprotinin，5 μg/mL leupeptin]中，用電動(dòng)組織勻漿器研磨(1 000 r/min離心20 s)，13 000 r/min離心10 min，重復(fù)2次，取上清-80℃保存?zhèn)溆??？偟鞍诐舛韧ㄟ^BCA protein reagent kit (23225，Pirce)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2Western blot 取50 mg總蛋白與5×上樣緩沖液(10% SDS，1 mmol/L DTT，20%甘油，0.2 mol/L Tris pH 6.8，0.05% 溴酚藍(lán))4∶1混合，42℃水浴，10 min，經(jīng)10% SDS-PAGE電泳后電轉(zhuǎn)至PVDF膜上(22 V，12 h，4℃)。將PVDF膜用含有5%脫脂牛奶的TBST緩沖液(含有0.01% Tween20的TBS)封閉，與一抗室溫孵育1 h，一抗分別采用CFTR217抗體(1∶5 000)、P-JNK(1∶200)、JNK(1∶200)、P-AKT(1∶300)和AKT(1∶300)，用含有5%胎牛血清(FBS)的TBST配制。一抗孵育結(jié)束后洗膜3次，每次5 min。二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG，室溫下孵育1 h，TBST洗膜3次，然后采用ECL試劑盒于暗室中顯影。

1.2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理數(shù)據(jù) 應(yīng)用SPS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1CFTR-/-小鼠肝臟中CFTR表達(dá)呈陰性 將通過基因型鑒定為CFTR基因敲除的小鼠，通過Western blot在蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗(yàn)證了沒有CFTR表達(dá)，陽性對(duì)照為其同窩野生型(wild type，wt)小鼠(圖1上)。

2.2CFTR-/-小鼠肝臟中JNK表達(dá)水平顯著升高與野生型小鼠肝組織相比較，CFTR-/-小鼠肝臟中P-JNK表達(dá)水平顯著升高，與其野生型同胞相比較P-JNK表達(dá)水平提高了約1.59倍(t=2.8972，P<0.05，圖2)。

2.3CFTR-/-小鼠肝臟中AKT表達(dá)水平顯著升高與野生型小鼠肝組織相比較，CFTR-/-小鼠肝臟中P-AKT表達(dá)水平顯著升高，與其野生型同胞相比較，P-AKTK表達(dá)水平提高了約1.31倍(t=3.1179，P<0.05，圖3)。

注：WT小鼠肝臟有CFTR表達(dá)，野生型CFTR有2條條帶分別為完全糖基化的CFTR(C-band)和核心糖基化的CFTR(B-band)。*為非特異性條帶。

圖1CFTR在野生型小鼠(WT)和CFTR敲除小鼠(CFTR-/-)肝組織中的表達(dá)分析

注：A：采用Western blot方法對(duì)野生型小鼠(WT)和CFTR敲除小鼠肝組織中JNK(表達(dá)總量)和P-JNK(活化的JNK)的表達(dá)水平進(jìn)行分析。B：JNK活性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；JNK的相對(duì)活性采用P-JNK/JNK進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比較，P-JNK在CFTR-/-小鼠肝組織中提高約1.59倍(t=2.8972，aP<0.05)。

圖2野生型小鼠(WT)和CFTR-/-小鼠肝組織中JNK活性分析

注：A：采用Western blot方法對(duì)野生型小鼠(WT)和CFTR敲除小鼠肝組織中AKT(表達(dá)總量)和P-AKT(活化的AKT)的表達(dá)水平進(jìn)行分析。B：AKT活性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；AKT的相對(duì)活性采用P-AKT/AKT進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)與WT小鼠相比較，P-AKT在CFTR-/-小鼠肝組織中提高約1.31倍(t=3.1179，aP<0.05)。

圖3野生型小鼠(WT)和CFTR-/-小鼠肝組織中AKT活性分析

3 討 論

3.1CFTR是潛在的抗炎因子 CF患者中，感染是最主要的癥狀之一，炎癥首先出現(xiàn)在呼吸道及肺部，繼而發(fā)生在肝臟和胰腺，65.2%左右的CF患者會(huì)患有肝病，稱為囊性纖維化相關(guān)的肝病(cystic fibrosis related liver disorder，CFLD)[4]。CFLD與CFTR突變喪失功能密切相關(guān)，因此，CFTR可能具有抗炎因子的作用。為此我們利用CFTR敲除小鼠的肝臟組織，檢查了炎癥相關(guān)因子JNK和AKT的活性變化。

JNK，參與哺乳類細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路，JNK作為一種炎性因子，參與細(xì)胞的多種生理病理過程[5]。JNK磷酸化(P-JNK)水平增高是其激活的體現(xiàn)。我們?cè)诒狙芯恐邪l(fā)現(xiàn)CFTR-/-小鼠肝臟中P-JNK表達(dá)水平比其野生型同胞提高約1.59倍(P<0.05，n=5)，說明CFTR-/-小鼠肝臟有慢性炎癥。

AKT，是一種絲氨酸/蘇氨酸特異性蛋白激酶。AKT參與細(xì)胞多種生理病理過程，PI3K/AKT信號(hào)活化，能夠促使細(xì)胞產(chǎn)生大量炎性因子，在機(jī)體炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，AKT磷酸化(P-AKT)水平升高是ATK活化的標(biāo)志[6]。為此我們檢測(cè)了CFTR-/-小鼠肝組織中P-ATK的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與其野生型同胞相比較，P-AKT水平升高約1.31倍。結(jié)合P-JNK在CFTR-/-小鼠肝組織中升高，說明CFTR-/-小鼠肝組織中有炎癥發(fā)生。

3.2CFTR缺失而導(dǎo)致肝臟慢性炎癥可能會(huì)影響腸道微生態(tài)平衡 CF患者多會(huì)出現(xiàn)腸梗阻等消化系統(tǒng)疾病，而肝臟在維持腸道微生態(tài)中發(fā)揮著重要作用，例如膽汁能夠調(diào)節(jié)腸道菌群平衡并抑制有害細(xì)菌生長(zhǎng)；反之，腸道益生菌具有促進(jìn)腸肝循環(huán)的作用。因此，肝臟出現(xiàn)慢性炎癥會(huì)影響腸道肝臟的相互調(diào)控，從而破壞腸道的微生態(tài)平衡，也會(huì)影響腸道菌群對(duì)腸肝代謝的調(diào)控[7]。

本研究利用CFTR-/-小鼠肝組織，發(fā)現(xiàn)炎性細(xì)胞因子JNK和AKT活性均顯著提高，說明CFTR-/-小鼠肝組織中有炎癥發(fā)生，為進(jìn)一步了解CFLD及CFTR突變情況下肝病的發(fā)生機(jī)制以及CFTR突變對(duì)腸道微生態(tài)的影響奠定了基礎(chǔ)。

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