單味中藥對(duì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌體外抑菌作用的研究

李凱旋，趙小軍，魏娟，王建云，潘奇

西安醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院 檢驗(yàn)科，陜西 西安 710038

鮑曼不動(dòng)桿菌(Acinetobacterbaumannii，A.baumannii)是我國院內(nèi)感染最常見的病原菌之一，是一類氧化酶陰性、非發(fā)酵糖的革蘭陰性桿菌，調(diào)查顯示全球不同國家多重耐藥、廣泛耐藥、全耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌都呈流行趨勢(shì)[1]。對(duì)臨床常用抗菌素的耐藥率達(dá)84.96%[2]，感染率最高的是重癥監(jiān)護(hù)病房(ICU)患者，病死率也逐年增高，達(dá)10%～43%[3]，引起國內(nèi)外醫(yī)療機(jī)構(gòu)極高的關(guān)注。因此，探索尋找新的抗菌藥物或藥物增效劑迫在眉睫。傳統(tǒng)中藥在治療感染性疾病方面有著悠久的歷史，相關(guān)研究顯示中藥制劑對(duì)多重耐藥細(xì)菌有明顯的抑菌作用[4]。本研究采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法對(duì)板藍(lán)根、魚腥草、黃芩、黃連、五倍子、金銀花、苦參、連翹、烏梅和穿心蓮等10種單味中藥免煎顆粒劑的體外抑菌作用進(jìn)行檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1菌株的選取 收集來自本院2016年1月到12月門診及住院患者的各種臨床標(biāo)本30株，包括痰液23株，傷口分泌物3株，血培養(yǎng)3株，尿液1株。選擇標(biāo)準(zhǔn)菌株大腸埃希菌ATCC 25922、銅綠假單胞菌 ATCC 27853(均購于上海三踏生物科技有限公司)用于對(duì)比分析。

1.2中藥顆粒劑 板藍(lán)根、魚腥草、黃芩、黃連、五倍子、金銀花、苦參、連翹、烏梅和穿心蓮均由廣東一方藥業(yè)公司提供，工藝先進(jìn)，質(zhì)量可靠。

1.3儀器和耗材 全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀VITEK-2(法國生物梅里埃公司)，恒溫培養(yǎng)箱(上海躍進(jìn)醫(yī)療器械有限公司)，細(xì)菌比濁儀(山東鑫科生物科技股份有限公司)，精密分析天平(Mettler-Toledo儀器上海有限公司)，瓊脂粉(杭州濱和微生物試劑有限公司)，LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基(杭州濱和微生物試劑有限公司)，96孔細(xì)胞培養(yǎng)板(賽業(yè)生物科技有限公司)。

1.4方法

1.4.1細(xì)菌分離及鑒定 對(duì)臨床分離的各種標(biāo)本進(jìn)行接種、培養(yǎng)，參照《臨床微生物學(xué)操作規(guī)程》，用法國生物梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行細(xì)菌鑒定，采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法和微量肉湯稀釋法相結(jié)合進(jìn)行藥敏分析，參照美國CLSI標(biāo)準(zhǔn)(2012版)規(guī)定進(jìn)行結(jié)果判定，篩選出符合實(shí)驗(yàn)要求的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌。

1.4.2中藥顆粒劑的制備 取適量中藥免煎顆粒劑用精密分析天平精確稱量，倒入燒杯中用無菌蒸餾水溶解，得每毫升相當(dāng)于1 g中藥材的中藥免煎顆粒溶液，用濾紙過濾去除藥渣顆粒，分裝于試管中121℃高壓滅菌15～20 min，收集濾液靜置備用。

1.4.3液體培養(yǎng)基的配制 稱取5.5 g營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基于錐形瓶中，加入250 mL蒸餾水，震蕩搖勻使培養(yǎng)基完全溶解，必要時(shí)加熱煮沸，用橡膠塞封口，121℃高壓滅菌15～20 min，超凈臺(tái)放涼備用。

1.4.4菌懸液的制備 將凍存的已經(jīng)過臨床分離鑒定的多重耐藥A.baumannii接種于血平板中，35℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取分離純化的菌落于無菌生理鹽水中，校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫取?/p>

1.4.5藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法 用打孔器將新華1號(hào)定性濾紙制成直徑為5 mm的小紙片，放入平皿中，121℃高壓滅菌15～20 min，取出放涼即為無菌紙片。MH瓊脂平板均勻涂上0.5麥?zhǔn)蠁挝坏木鷳乙海x取亞胺培南藥敏紙片作陽性對(duì)照貼于中間，6片無菌小紙片貼于四周，用滅菌的加樣槍加入10 μL的中藥顆粒劑溶液，每種顆粒劑重復(fù)3次，35℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24 h后測(cè)量抑菌圈的大小，所有結(jié)果取平均值計(jì)算。

1.4.6最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定 96孔細(xì)胞培養(yǎng)板高壓滅菌，將第一排和第二排標(biāo)記為“肉湯空白對(duì)照、肉湯加菌陽性對(duì)照”。第三排第一孔加入相當(dāng)于1 g/mL的中藥濾清液200 μL，依次每孔加入100 μL肉湯對(duì)中藥濾清液進(jìn)行倍比稀釋，第三排只加藥液作為藥液對(duì)照組。第四排第一孔加入相當(dāng)于1 g/mL的中藥濾清液100 μL，依次每孔加入100 μL菌懸液，從第二孔開始加入1 g/mL的中藥濾清液100 μL倍比稀釋，這樣每孔的藥物濃度與第三排每孔的藥物濃度相同形成對(duì)照。按上述方法，依次加入10種中藥濾清液，將細(xì)胞培養(yǎng)板置于35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，觀察有無細(xì)菌生長。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，10種中藥免煎顆粒對(duì)多重耐藥A.baumannii的MIC值比較采用t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法 10種中藥免煎顆粒劑對(duì)隨機(jī)選取的10株多重耐藥A.baumannii抑菌效果各不同，五倍子抑菌作用最強(qiáng)，黃芩次之；五倍子抑菌圈直徑為17～30 mm，黃芩抑菌圈直徑為9～22 mm；黃連、魚腥草抑菌活性相對(duì)較弱，而烏梅、連翹、板藍(lán)根、苦參、金銀花和穿心蓮的抑菌作用很弱甚至無抑菌作用(表1)。

表1 中藥五倍子、黃芩對(duì)臨床多重耐藥A. baumannii的抗菌作用

2.2微量肉湯稀釋法 結(jié)果顯示五倍子對(duì)多重耐藥A.baumannii抑菌作用最強(qiáng)，MIC值為0.975 mg/mL；黃芩次之，MIC值為15.63 mg/mL；烏梅抑菌作用相對(duì)較弱，MIC值為62.5 mg/mL；而黃連、魚腥草、連翹、板藍(lán)根、苦參、金銀花和穿心蓮的抑菌作用很弱甚至無抑菌作用(t=1.639，P>0.05)(表2)。

表2 10種中藥免煎顆粒對(duì)MDR-AB的體外抑菌活性

注：“-”有抑菌活性，“+”無抑菌活性(肉眼觀察)。

3 討 論

3.1鮑曼不動(dòng)桿菌耐藥現(xiàn)狀 據(jù)權(quán)威部門統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，抗菌素在我國醫(yī)療行為中的使用率高達(dá)70%，遠(yuǎn)高于歐美等發(fā)達(dá)國家，但真正需要抗菌素治療的疾病不到20%[5]。濫用抗菌素成為我國多重耐藥細(xì)菌逐年增多的重要原因。A.baumannii是一種條件致病菌，最常見于住院患者尤其是燒傷患者或ICU患者，主要由長期應(yīng)用抗菌藥物、留置管道、各種侵入性操作、基礎(chǔ)疾病長期臥床、機(jī)體免疫力低下等因素導(dǎo)致感染[6]。A.baumannii僅對(duì)多粘菌素B的敏感性最高，耐藥率為1.4%，但因其腎毒和神經(jīng)毒性作用，臨床甚少使用；對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦、米諾環(huán)素、左氧氟沙星和阿米卡星的耐藥率分別為33.0%、42.2%、45.5%和40.2%，對(duì)頭孢吡肟、頭孢西丁、頭孢他啶、亞胺培南、美羅培南和環(huán)丙沙星等耐藥率均在50%以上，且有逐年增高的趨勢(shì)[7-9,11]。因此探索新型抗菌藥物或藥物替代劑已成為國內(nèi)外相關(guān)學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。

3.2中藥抑菌研究分析 中國傳統(tǒng)中藥抑菌譜廣，毒副作用小，在菌體內(nèi)作用途徑多樣化，能產(chǎn)生多方面藥理效應(yīng)，且具有避免細(xì)菌耐藥和抑制細(xì)菌生長的功效，與抗菌藥物聯(lián)合使用更能增強(qiáng)抗菌藥物殺菌和抗感染能力，成為抗感染藥物的另一研究重點(diǎn)。有研究表明中藥可阻斷細(xì)菌某些組分的合成或抑制細(xì)菌外排泵，從而達(dá)到抑菌作用[9]。本研究通過對(duì)板藍(lán)根、魚腥草、黃芩、黃連、五倍子、金銀花、苦參、連翹、烏梅和穿心蓮等10味中藥免煎顆粒劑進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)五倍子對(duì)A.baumannii抑菌作用最強(qiáng)，抑菌圈直徑為17～30 mm，MIC值為0.975 mg/mL；與陳澤慧[10]報(bào)道的五味子、石榴皮等中草藥對(duì)A.baumannii有一定的抑菌作用結(jié)果一致。黃芩也有較好的抑菌效果，抑菌圈直徑為9～22 mm，MIC值為15.63 mg/mL；烏梅抑菌活性相對(duì)較弱，MIC值為62.5 mg/mL；而黃連、魚腥草、連翹、板藍(lán)根、苦參、金銀花和穿心蓮的抑菌活性很弱甚至無抑菌效果。五倍子對(duì)革蘭陰性菌和陽性菌均有很好的抑菌作用，這與五倍子含有大量鞣質(zhì)，可與細(xì)菌蛋白質(zhì)結(jié)合形成鞣質(zhì)蛋白，從而起到抑制或殺滅細(xì)菌的作用有關(guān)[2,9]。

3.3本研究不足及后期方向 本研究為臨床治療多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染提供新的治療思路，但發(fā)揮抑菌作用的具體中藥抑菌成分仍不太清楚，目前國內(nèi)外中藥抑菌研究都處于體外實(shí)驗(yàn)階段，抗菌中藥的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)仍然較少[12]。因此，選擇合適的實(shí)驗(yàn)方法，加強(qiáng)對(duì)中藥抑菌活性成分和機(jī)制的研究，使其更具有科學(xué)性、理論性；為今后體外實(shí)驗(yàn)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、臨床試驗(yàn)及應(yīng)用提供理論依據(jù)，確保藥物的安全性和有效性，使中藥的抑菌活性真正發(fā)揮其功效。期望具有抑菌活性的中藥能在多重耐藥A.baumannii感染中發(fā)揮作用。

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