應(yīng)用16S rRNA測(cè)序法對(duì)過敏性鼻炎患者鼻前庭菌群組成分析

王笛，陳昊，徐夢(mèng)雅，李子豪，單修祺，鄭蘭艷

中國醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室，遼寧 沈陽 110122

過敏性鼻炎(AR)是一種耳鼻喉科常見的呼吸道變態(tài)反應(yīng)性疾病，雖不危及生命但卻嚴(yán)重影響人們的生活質(zhì)量。截止到2001年，過敏性鼻炎已累及全球近四分之一的人口[1]。因此，對(duì)其致病原因的探討尤為重要。過敏性鼻炎的致病因素有很多，如花粉、動(dòng)物皮毛和霉菌[2]，且與遺傳因素關(guān)系密切[3]。近年來，鼻腔中的微生物組成與過敏性鼻炎的關(guān)系也受到了人們的密切關(guān)注[4]。有學(xué)者提出慢性鼻竇炎中的大多數(shù)常見菌可能與AR發(fā)病具有正相關(guān)性[5-6]。但這些研究都依賴于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式，因此無法反應(yīng)鼻腔微生物的真實(shí)組成。近年來二代高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，為我們分析鼻腔微生物的組成與過敏性鼻炎的相互關(guān)系提供了很好的研究平臺(tái)。本研究采用16S rRNA高通量測(cè)序法分析過敏性鼻炎患者鼻前庭微生物組成與正常人的差異，以期揭示過敏性鼻炎患者鼻前庭微生物的組成變化與過敏性鼻炎的發(fā)病以及疾病進(jìn)展的關(guān)系，為過敏性鼻炎的個(gè)性化診療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要試劑 鼻前庭拭子培養(yǎng)管(江蘇天力)，總DNA提取試劑盒QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，Hilden，Germany)。

1.1.2研究對(duì)象 受試者分兩組，試驗(yàn)組、對(duì)照組各15人，無性別或年齡偏倚。所有樣本均取自沈陽市第八人民醫(yī)院，歷時(shí)3個(gè)月?？紤]到各種可能造成鼻前庭菌群變化的因素，受試者入組標(biāo)準(zhǔn)包括：(1)年齡在20～50歲；(2)3個(gè)月內(nèi)未服用抗生素；(3)不吸煙；(4)未接受任何口腔治療或外科手術(shù)；(5)無懷孕或哺乳期婦女；(6)無系統(tǒng)性疾病。試驗(yàn)組均具有典型癥狀，臨床診斷為過敏性鼻炎，并處于臨床發(fā)作期。

1.2方法

1.2.1標(biāo)本采集 取出培養(yǎng)管中的無菌棉簽，快速輕柔地旋轉(zhuǎn)擦拭鼻前庭部，每側(cè)各2次，并立即置于-20℃保存。

1.2.2克隆與測(cè)序 根據(jù)QIAamp DNA Mini Kit使用說明提取微生物總DNA。PCR擴(kuò)增16S V3-V4可變區(qū)，將擴(kuò)增產(chǎn)物用HiSeq 300PE測(cè)序。

1.2.3生物信息學(xué)分析 利用Qiime生物信息平臺(tái)分析下機(jī)數(shù)據(jù)，高質(zhì)量數(shù)據(jù)以97%序列相似性[7]進(jìn)行OTU(operation taxonomy units)聚類。隨后進(jìn)行物種注釋及豐度分析。α多樣性分析(alpha diversity)揭示樣品中的物種構(gòu)成，β多樣性分析(beta diversity)可挖掘樣品之間的差異[8]。

1.2.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 本實(shí)驗(yàn)使用兩樣本雙側(cè)t檢驗(yàn)來比較過敏性鼻炎患者與健康人群鼻前庭部菌群的差別，按照α=0.05的水準(zhǔn)來進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)意義的判定。

2 結(jié) 果

2.1alpha多樣性 稀疏曲線分析OTU在過敏性鼻炎患者樣本內(nèi)達(dá)到132時(shí)接近飽和，在健康人體樣本內(nèi)達(dá)到141接近飽和，且兩組曲線接近，意味著兩組鼻腔群落的豐度接近，兩組樣本測(cè)序深度足夠(圖1A)。Chao1和ACE豐度指標(biāo)進(jìn)一步驗(yàn)證了如上觀點(diǎn)(圖1B)。在本研究中菌群的均勻度我們用Simpsoneven指數(shù)進(jìn)行了分析(圖1C)

注：A：稀釋曲線；橫軸顯示通過測(cè)序獲得的序列的數(shù)量，縱軸顯示在97%序列間相似性的水平下的單元數(shù)，為采用的測(cè)序工作表示物種數(shù)量的近似值，水平線代表不同的OTU±標(biāo)準(zhǔn)誤差的平均數(shù)(SE)。B：箱線圖顯示了AR組和對(duì)照組使用三種不同的豐度指數(shù)OTUs的平均總數(shù)：Chao1(S.Chao1)、ACE(S.ACE)和觀察到的物種的度量(s.obs)。C：菌種的均勻度經(jīng)Simpsoneven指數(shù)分析，鼻炎組和健康對(duì)照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=0.715，P=0.481)。

圖1兩組研究對(duì)象alpha多樣性分析

2.2組間beta多樣性 通過加權(quán)UniFrac距離測(cè)量的方式進(jìn)行主成分分析(PCoA)和盒子圖對(duì)過敏性鼻炎患者和健康人群菌群進(jìn)行了多樣性分析。實(shí)驗(yàn)基于weighted unifrac distance的多變量方差分析來比較過敏性鼻炎患者和健康人群兩組的主成分結(jié)構(gòu)。三維模式顯示兩組主成分差別較大(圖2A)。多變量方差分析的盒子圖結(jié)果證實(shí)了過敏性鼻炎患者鼻前庭菌群與健康對(duì)照組差異較大(t=-2.84，P=0.005),且健康組的樣本數(shù)據(jù)相似度很高(圖2B)，以上結(jié)果表明過敏性鼻炎患者組鼻腔菌群樣本之間差異較大，即患者的鼻腔菌群異質(zhì)性高。

2.3菌群組成結(jié)構(gòu)的比較 在菌群門的水平上，過敏性鼻炎患者鼻腔中菌群按豐度遞減依次為：變形菌門(Proteobacteria)(55.37%)，厚壁菌門(Firmicutes)(25.22%)，放線菌門(Actinobacteria)(8.29%)，藍(lán)藻(Cyanobacteria)(6.80%)，擬桿菌門(Bacte-roidetes)(3.00%)，梭桿菌門(Fusobacteria)(0.86%)，TM7(0.17%)，嗜熱菌門(Thermi)(0.12%)，酸桿菌門(Acidobacteria)(0.11%)，綠彎菌門(Chlo-roflexi)(0.04%)。而健康受試者中，鼻腔中菌群按豐度遞減依次為變形菌門(38.46%)，厚壁菌門(32.44%)，放線菌門(26.40%)，擬桿菌門(1.72%)，藍(lán)藻(0.63%)，酸桿菌門(0.13%)，嗜熱菌門(0.09%)，梭菌門(0.08%)，綠彎菌門(0.04%)，TM7(0.02%)。過敏性鼻炎患者較健康受試者，厚壁菌門、放線菌門豐度有所減少，而變形菌門、梭桿菌門、擬桿菌門、藍(lán)藻、TM7、嗜熱菌門、酸桿菌門豐度較健康受試者相對(duì)增加，其中放線菌門(t=-3.184，P=0.004)和梭桿菌門(t=2.107，P=0.046)在試驗(yàn)組與對(duì)照組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3A)。在菌群屬的研究水平上，試驗(yàn)組與對(duì)照組之間有明顯差異的屬有13種，包括黃單胞菌科(Xanthomonadaceae)中的一個(gè)未注釋的菌屬(t=-4.0740，P=0.0004)、棒狀桿菌屬(Corynebacterium)(t=-3.1640，P=0.004)、嗜胨菌屬(Peptonophilus)(t=-3.0289，P=0.0057)、厭氧球菌屬(Anaerococcus)(t=-2.9675，P=0.0067)、大芬戈?duì)柕戮鷮?Finegoldia)(t=-2.8727，P=0.0113)、丙酸桿菌屬(Propionibacterium)(t=-2.7430，P=0.0113)、短桿菌屬(Brachybacterium)(t=-2.3448，P=0.0276)、希瓦菌屬(Shewanella)(t=2.3308，P=0.0285)、微小單胞菌屬(Parvimonas)(t=2.1943，P=0.0381)、考克菌屬(Kocuria)(t=-2.1766，P=0.03656)、鞘脂單胞菌科(Sphingomonadaceae)科中的一個(gè)未注釋的菌屬(t=2.1030，P=0.0461)、嗜鹽單胞菌屬(Halomonas)(t=2.0763，P=0.0487)和葉瘤菌屬(Phyllobacterium)(t=2.0718，P=0.0491)(圖3B)。圖中只顯示了菌屬豐度不低于0.1%的9個(gè)差異明顯的菌屬，其他低豐度的差異明顯的菌屬未在圖中顯示。

注：A：通過加權(quán)UniFrac距離測(cè)量的方式進(jìn)行主坐標(biāo)分析(PCoA)，主坐標(biāo)分析由三維模式表現(xiàn)，同時(shí)在97%序列一致性條件下進(jìn)行序列聚類。根據(jù)細(xì)菌組成的26個(gè)樣品的空間分布，包括AR組(藍(lán)圈)和對(duì)照組(紅圈)；每一點(diǎn)對(duì)應(yīng)一個(gè)微生物群落，顏色指示它的類別。B：箱線圖顯示組內(nèi)和組間差異性比較得出的平均加權(quán)UniFrac距離；通過UniFrac距離和參數(shù)t檢驗(yàn)證明它們存在顯著的差異。

圖2兩組研究對(duì)象beta多樣性分析

注：A：在門層次上比較AR組和健康對(duì)照組的菌群組成差異；Y軸代表菌群的相對(duì)豐度，X軸代表各種菌群；單星號(hào)表示差異顯著，P<0.05，雙星號(hào)代表差異非常顯著，P<0.01。B：在菌屬層次上比較AR組和對(duì)照組的菌群組成差異；Y軸代表菌群的相對(duì)豐度，X軸代表各種菌群；單星號(hào)表示差異顯著，P<0.05; 雙星號(hào)代表差異非常顯著，P<0.01。

圖3兩組研究對(duì)象菌群組成結(jié)構(gòu)的比較

3 討 論

3.1結(jié)果分析 在菌群門的水平上，本研究中健康人群鼻前庭的主要優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門、厚壁菌門、放線菌門，與以往的研究結(jié)果相同，即健康人體鼻腔中主要的細(xì)菌門是放線菌門(50.7%～68.0%)、厚壁菌門(24.7%～27.0%)和變形菌門(4.0%～20.7%)[2,9]。盡管所占比例有所差異，這種差異可能受患者所處地理環(huán)境、人口水平和患者皮膚菌群的復(fù)雜程度影響，比如環(huán)境濕度就是影響放線菌門的一個(gè)重要外界因素[10]。

在菌群屬的研究水平上，過敏性鼻炎患者與健康對(duì)照組之間有明顯差異的菌屬有13個(gè)，其中，過敏性鼻炎患者的黃單胞菌科中的一個(gè)未注釋的菌屬、棒狀桿菌屬、嗜胨菌屬、厭氧球菌屬、大芬戈?duì)柕戮鷮?、丙酸桿菌屬、短桿菌屬和考克菌屬共8個(gè)菌屬的豐度較健康受試者菌群明顯減少。而過敏性鼻炎患者的希瓦菌屬、微小單胞菌屬、鞘脂單胞菌科中的一個(gè)未注釋的菌屬、嗜鹽單胞菌和葉瘤菌屬共5個(gè)菌屬的豐度較健康受試者明顯升高。棒狀桿菌屬一般出現(xiàn)在土壤、水源、植物和食品中,它們中的大部分是無害的，也沒有致病性，但可利用非典型途徑進(jìn)入組織(傷口)或產(chǎn)生機(jī)會(huì)性致病[11]。非白喉棒狀桿菌甚至可見于人和動(dòng)物體內(nèi)黏膜及皮膚表面[12]。嗜胨菌屬是陰道和腸道菌群的一部分[13]，其出現(xiàn)在糖尿病患者皮膚表面、軟組織感染、關(guān)節(jié)感染、手術(shù)部位感染、絨毛膜羊膜炎和血液感染中[14]。厭氧球菌屬可以導(dǎo)致人體不同部位的感染，如中耳炎、口腔感染、鼻竇炎和創(chuàng)傷后感染，此類菌在人體皮膚及黏膜腔內(nèi)深處表面廣泛存在。大芬戈?duì)柕戮且环N機(jī)會(huì)性人體致病菌，通常定居在皮膚及黏膜表面[15]，常見于慢性潰瘍患者生物膜，如肥胖患者腳部及褥瘡性潰瘍[16]。研究表明，丙酸桿菌屬是最流行的與人體皮膚相關(guān)的菌屬[17]。主要為兼性寄生，或共生于人體及其他動(dòng)物，多存在汗腺、皮脂腺或皮膚其他地方。實(shí)際上這些細(xì)菌無處不在，對(duì)大多數(shù)人來說不會(huì)造成問題，但與痤瘡及某些皮膚問題有一定關(guān)聯(lián)[18]。以上證據(jù)表明過敏性鼻炎較健康受試者較少的菌屬大部分與人體皮膚和黏膜有關(guān)，都是人體的正常菌群，因此我們推測(cè)過敏性鼻炎與人體鼻腔的微生態(tài)失調(diào)相關(guān)。

3.2研究現(xiàn)狀與創(chuàng)新性 研究發(fā)現(xiàn)，鼻腔微生物在過敏性鼻炎的發(fā)病過程中占有十分重要的地位。早在1989年,就有衛(wèi)生假說表明，鼻腔病原體的暴露可能導(dǎo)致機(jī)體耐受性增高[19]，兒童患過敏性鼻炎的速度明顯降低。在2012年Heydenreich等報(bào)道某些G+菌能作為佐劑增強(qiáng)樹突細(xì)胞成熟和炎癥Th1、Th2和Th17的應(yīng)答，提示微生物群落對(duì)過敏性鼻炎確實(shí)有影響[20]。還有學(xué)者提出慢性鼻竇炎中的大多數(shù)常見菌如肺炎鏈球菌、痤瘡丙酸桿菌、棒狀桿菌、流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌可能與AR發(fā)病具有正相關(guān)性[5-6]。2014年Choi等用RFLP檢測(cè)過敏性鼻炎患者鼻腔微生物群落的變化，結(jié)果表明，過敏性鼻炎患者的中鼻道內(nèi)較健康對(duì)照組有更多種類的微生物，細(xì)菌多樣性的升高與過敏性炎癥反應(yīng)相關(guān)[21]。但這些研究都依賴于傳統(tǒng)的培養(yǎng)方式，而傳統(tǒng)培養(yǎng)方式無法分析低豐度細(xì)菌及不能培養(yǎng)的細(xì)菌，因此無法反應(yīng)鼻腔微生物的真實(shí)組成，且耗時(shí)長(zhǎng)、工作量大。16S rRNA是原核生物核糖體16S亞基的基因的編碼產(chǎn)物，存在于所有細(xì)菌基因中，占細(xì)菌總RNA的80%以上。其序列長(zhǎng)短適中，既有保守區(qū)又有高變區(qū)，其中可變區(qū)的V3-V4區(qū)可作為菌群分類的標(biāo)志[22]。高通量測(cè)序以其極低單堿基測(cè)序成本和超高數(shù)據(jù)產(chǎn)出量為特征，為基因組學(xué)和后基因組學(xué)研究領(lǐng)域帶來了新的研究方法和解決方案。16S rDNA高通量測(cè)序技術(shù)可對(duì)數(shù)百萬DNA分子同時(shí)測(cè)序，具有高準(zhǔn)確性，高通量，高靈敏度和低運(yùn)行成本等突出優(yōu)勢(shì)。因此本研究選擇此方式進(jìn)行鼻前庭菌群組成的研究，以期能更真實(shí)地反映過敏性鼻炎的鼻腔微生物的真實(shí)組成。

3.3研究意義 為了探索鼻前庭微生物的變化與過敏性鼻炎的關(guān)系，以期揭示鼻腔微生態(tài)與過敏性鼻炎的相關(guān)性，期望能為過敏性鼻炎的個(gè)性化診療提供幫助。

3.4不足之處 由于實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)的限制，本課題樣品的數(shù)量有限，但據(jù)此我們可以做出合理性推測(cè)，健康人體和過敏性鼻炎患者鼻前庭微生物群落存在差異，這些差異菌群值得我們進(jìn)一步深度研究。

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