幽門螺桿菌對胃癌前期階段胃上皮DNA同源重組修復(fù)關(guān)鍵蛋白的影響

董海濱，米陽，黃煌，梅璐，何曉燕，李彥偉，鄭鵬遠(yuǎn)

1.消化內(nèi)科；2.病理科，鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450000

幽門螺桿菌(Helicobacterpylori，H.pylori)是一種主要定植在胃黏膜表面的革蘭陰性菌[1]。世界上約有50%人口被H.pylori感染[2]，其傳播方式主要是人與人之間的口口和糞口傳播，有明顯的家庭聚集現(xiàn)象[3]。各種流行病學(xué)顯示，H.pylori感染是胃炎、胃十二腸潰瘍、胃淋巴瘤和胃癌的主要病因[4]，并被WHO認(rèn)為是一類致癌原[5]。既往研究表明，H.pylori主要作用于胃癌前期階段，即胃上皮腸化及之前階段，亦即H.pylori啟動了胃癌的發(fā)生[6]。但是H.pylori感染引起胃癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制一直尚未闡明，其中H.pylori感染引起胃上皮DNA損傷及修復(fù)機(jī)制是近年來研究的熱點(diǎn)[7]。DNA雙鏈損傷主要通過兩種方式修復(fù)，不精確的非同源重組(non-homologous end join，NHEJ)修復(fù)和精確的同源重組(homologous recombination，HR)修復(fù)[8]。研究表明，H.pylori感染可以導(dǎo)致胃上皮細(xì)胞DNA雙鏈斷裂，但卻抑制很多DNA修復(fù)相關(guān)基因[9]。H.pylori感染細(xì)胞帶著未經(jīng)準(zhǔn)確修復(fù)的DNA損傷，繼續(xù)增殖分裂，進(jìn)入了細(xì)胞惡變進(jìn)程[10]。因此，闡明H.pylori抑制DNA修復(fù)，特別是HR精確修復(fù)的分子機(jī)制是急需探討的重要問題，也是闡明胃癌癌前病變發(fā)生分子機(jī)制的重要方向。本研究中，我們將分析胃癌前期不同階段H.pylori陽性與陰性患者胃黏膜上皮組織DNA損傷標(biāo)志物及HR修復(fù)通路中關(guān)鍵蛋白的表達(dá)情況，探討H.pylori在胃癌前期是通過哪些靶點(diǎn)抑制HR修復(fù)，揭示H.pylori在推動胃癌前期發(fā)展過程中的分子機(jī)制，從而為胃癌的早期診斷以及今后的精準(zhǔn)治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1標(biāo)本來源 鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院2017年3月-9月因消化道不適癥狀行胃鏡檢查患者165例，除外心腦血管疾病、肝腎功能衰竭、胃潰瘍、胃部手術(shù)、大量吸煙飲酒史、H.pylori根除史、近2周用藥史(抗生素、質(zhì)子泵抑制劑、抗腫瘤藥物等)。內(nèi)鏡下取胃竇病變部位胃黏膜上皮組織，制作蠟塊。切片后行HE染色確定病理類型，其中慢性淺表性胃炎(CSG)80例、萎縮性胃炎(CAG)32例、腸上皮化生(IM)35例、不典型增生(Dys)18例。免疫組織化學(xué)方法確定H.pylori感染情況，其中H.pylori陽性患者78例，平均年齡(54.1±13.4)歲；H.pylori陰性患者87例，平均年齡(53.9±13.6)歲。所有患者均知情同意。

1.1.2實(shí)驗(yàn)試劑 γH2AX抗體來自德國柏林馬克思普朗克感染生物學(xué)研究所Thomas F. Meyer教授饋贈，鼠抗MRE11多克隆抗體(ab214)購自美國Abcam公司，鼠抗Rad51多克隆抗體(MA5-14419)、兔抗CtIP多克隆抗體(PA5-20963)購自美國Thermo Fisher公司，兔抗H.pylori多克隆抗體(ZA-0127)、兔二抗試劑盒(SP-9001)、鼠二抗試劑盒(SP-9002)、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋，PBS粉劑、檸檬酸鈉抗原修復(fù)液等均購自北京雷根公司。

1.1.3實(shí)驗(yàn)儀器 BMJ-B型包埋冷臺、PHY-Ⅲ病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀器有限公司)，LEICA RM2245組織切片機(jī)。

1.2方法

1.2.1組織切片 用切片機(jī)切取厚度為3 μm切片，撈片后攤片5 min，后置于烘片機(jī)內(nèi)70℃烘烤1 h，留作備用。

1.2.2免疫組織化學(xué) 將上述制備好切片置于二甲苯Ⅰ、Ⅱ中脫蠟各15 min，后置于無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脫苯各10 min，再置于95%、85%、75%梯度酒精水化各5 min，PBS清洗3次。檸檬酸鈉抗原修復(fù)液微波修復(fù)15 min，冷卻至室溫，PBS清洗3次。3%過氧化氫去離子水封閉內(nèi)源性過氧化物酶15 min，PBS清洗3次，山羊血清封閉15 min，傾去，滴加一抗，4℃孵育過夜。次日取出，PBS清洗3次。滴加生物素化二抗37℃孵育20 min，PBS清洗3次。再滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37℃孵育20 min，PBS清洗3次。DAB顯色劑顯色5 min，蒸餾水終止反應(yīng)。流水清洗15 min，蘇木素復(fù)染胞核5 min，自來水充分清洗。鹽酸酒精分化5 s，流水沖洗15 min。依次置于75%、85%、95%乙醇和無水乙醇Ⅰ、Ⅱ中脫水各5 min，二甲苯Ⅰ、Ⅱ透明各10 min，中性樹膠封片觀察?？瞻讓φ战M使用相同抗體稀釋液孵育過夜。

1.2.3病理結(jié)果判定與免疫組化評分 病理切片由兩名經(jīng)驗(yàn)豐富病理醫(yī)生讀片，結(jié)果根據(jù)悉尼標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定[11]。H.pylori免疫組化在胃黏膜上皮或腺管內(nèi)觀察到小短桿狀、黃褐色螺旋樣菌即為H.pylori陽性，反之為陰性。免疫組化評分采用德國半定量方法[12]，兩名病理科醫(yī)生雙盲評分平均而得。γH2AX、MRE11、Rad51、CtIP蛋白表達(dá)以胃黏膜腺管上皮細(xì)胞核呈黃至棕褐色為陽性細(xì)胞，無著色為陰性細(xì)胞。陽性細(xì)胞數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)：(1)陽性腺管上皮細(xì)胞數(shù)占總腺管上皮細(xì)胞數(shù)的百分比：<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；51%～75%為3分；≥75%為4分。(2)染色強(qiáng)度以視野中多數(shù)細(xì)胞所呈現(xiàn)的染色深淺計(jì)分：未著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(3)組織得分為陽性細(xì)胞所占比例計(jì)分和染色計(jì)分乘積，再根據(jù)以下判定結(jié)果統(tǒng)計(jì)陽性表達(dá)例數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析：0～2分陰性(-)，3～5分弱陽性(+)，6～8分中度陽性(++)，9～12分強(qiáng)陽性(+++)。

1.3統(tǒng)計(jì)分析 所得數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，等級資料多組間采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1DNA損傷標(biāo)記蛋白和HR修復(fù)關(guān)鍵蛋白在胃癌前期不同階段的分布和差異 DNA損傷標(biāo)記蛋白(γH2AX)和HR修復(fù)關(guān)鍵蛋白(MRE11、Rad51、CtIP)在胃黏膜組織腺管上皮細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，以及H.pylori在胃黏膜腺管內(nèi)的分布如圖1所示。4種蛋白在胃癌前期不同病理階段的表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖1 免疫組化檢測H.pylori及DNA損傷標(biāo)記蛋白和HR修復(fù)關(guān)鍵蛋白的表達(dá)(×400)

2.2H.pylori在胃癌前期不同階段對DNA損傷標(biāo)記蛋白和HR修復(fù)關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響 為進(jìn)一步明確H.pylori感染在胃癌前期不同病理階段對DNA損傷標(biāo)記蛋白和HR修復(fù)關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響，我們進(jìn)一步進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.2.1H.pylori對γH2AX表達(dá)的影響 在CSG、CAG、IM三組內(nèi)，γH2AX的表達(dá)H.pylori陽性組高于陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mann-WhitneyU=1116.5，P=0.001；Mann-WhitneyU=185.0，P=0.018；Mann-WhitneyU=214.5，P=0.041)；而在Dys組內(nèi)，H.pylori陽性與陰性亞組表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mann-WhitneyU=35.5，P=0.964)。見表1。

表1 H.pylori與γH2AX表達(dá)

注：CSG:慢性淺表性胃炎，CAG:慢性萎縮性胃炎，IM:腸上皮化生，Dys:異性增生。

2.2.2H.pylori對MRE11表達(dá)的影響 在CSG、CAG兩組內(nèi)，MRE11表達(dá)在H.pylori陽性亞組高于陰性亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mann-WhitneyU=1117.0，P=0.001；Mann-WhitneyU=201.0，P=0.002)；而在IM、Dys兩組內(nèi)，H.pylori陽性與陰性亞組內(nèi)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mann-WhitneyU=171.0，P=0.568；Mann-WhitneyU=41.5，P=0.616)。見表2。

表2 H.pylori與MRE11表達(dá)

注：CSG:慢性淺表性胃炎，CAG:慢性萎縮性胃炎，IM:腸上皮化生，Dys:異性增生。

2.2.3H.pylori對Rad51表達(dá)的影響 在CSG、IM兩組內(nèi)，Rad51表達(dá)在H.pylori陽性亞組內(nèi)表達(dá)低于陰性亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mann-WhitneyU=490.0，P=0.002；Mann-WhitneyU=73.0，P=0.007)；而在CAG、Dys兩組內(nèi)，H.pylori陽性與陰性亞組內(nèi)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mann-WhitneyU=101.0，P=0.404；Mann-WhitneyU=24.0，P=0.291)。見表3。

表3 H.pylori與Rad51表達(dá)

注：CSG:慢性淺表性胃炎，CAG:慢性萎縮性胃炎，IM:腸上皮化生，Dys:異性增生。

2.2.4H.pylori對CtIP表達(dá)的影響 在CSG、IM兩組內(nèi)，CtIP表達(dá)在H.pylori陽性亞組表達(dá)低于陰性亞組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mann-WhitneyU=593.0，P=0.044；Mann-WhitneyU=58.5，P=0.001)；而在CAG、Dys兩組內(nèi)，H.pylori陽性與陰性亞組內(nèi)表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Mann-WhitneyU=84.0，P=0.136；Mann-WhitneyU=18.5，P=0.102)。見表4。

表4 H.pylori與CtIP表達(dá)

注：CSG:慢性淺表性胃炎，CAG:慢性萎縮性胃炎，IM:腸上皮化生，Dys:異性增生。

3 討 論

3.1國內(nèi)外研究進(jìn)展 DNA損傷導(dǎo)致的基因組不穩(wěn)定性增加是癌癥發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制。DNA雙鏈斷裂是DNA損傷最嚴(yán)重的一種形式，可以導(dǎo)致基因缺失突變，甚至染色體重排異位等嚴(yán)重后果[13]。NHEJ和HR修復(fù)是DNA雙鏈斷裂時(shí)最主要的修復(fù)方式。其中NHEJ修復(fù)是不精確修復(fù)，而HR修復(fù)是高保真的精確修復(fù)。在細(xì)胞進(jìn)入S/G2期，MRE11和CtIP在HR修復(fù)早期剪切DNA斷裂末端，從而和CtIP一起以5′→3′端核酸內(nèi)切酶來剪切DNA斷端，從而也去掉了結(jié)合在DNA斷裂末端的Ku70/80，抑制了NHEJ修復(fù)，開啟了HR修復(fù)模式。剪切形成的DNA斷裂端懸臂被RPA結(jié)合，然后RPA被DNA重組酶Rad51取代，形成延長的DNA單鏈螺旋絲狀體，被稱為突觸前復(fù)合體。繼而用來配對同源DNA，為后繼精確修復(fù)提供模板，開啟了HR修復(fù)[14]。因此，MRE11、CtIP開啟了HR修復(fù)通路，而Rad51處于HR修復(fù)的核心地位，三個(gè)蛋白是HR修復(fù)通路的核心蛋白。γH2AX由DSB斷點(diǎn)附近組蛋白H2AX磷酸化而來，通過標(biāo)注DSB附近的核小體作為DNA損傷的分子標(biāo)記[15]。

以往在H.pylori感染細(xì)胞系模型中的研究表明，H.pylori感染可以抑制大部分DNA修復(fù)蛋白相關(guān)基因，包括某些HR修復(fù)蛋白的基因[9]。但對臨床H.pylori感染的患者胃黏膜中DNA損傷修復(fù)蛋白的相關(guān)研究較少，或多局限于胃癌終末階段胃上皮樣本?，F(xiàn)在主流研究認(rèn)為，H.pylori主要作用于胃癌前期階段，即腸化生階段之前[6]。H.pylori感染啟動了胃癌的發(fā)生。但對于H.pylori如何啟動胃癌發(fā)生的分子機(jī)制至今未解。因此，研究H.pylori在胃癌前期階段如何引起DNA損傷，以及如何抑制精確HR修復(fù)，就成了一個(gè)重要的研究方向。

3.2研究結(jié)果 本研究取自臨床胃癌前期不同階段患者胃黏膜標(biāo)本，發(fā)現(xiàn)在CSG、CAG和IM階段，H.pylori陽性組較陰性組γH2AX表達(dá)增多，從臨床標(biāo)本層面印證了H.pylori感染在胃腺癌前期導(dǎo)致胃黏膜細(xì)胞DNA雙鏈斷裂損傷。然后，進(jìn)一步分析HR修復(fù)的核心蛋白，發(fā)現(xiàn)在多數(shù)胃腺癌前期病理類型中，MRE11的表達(dá)在H.pylori陽性組內(nèi)高于陰性組，而Rad51和CtIP的表達(dá)H.pylori陽性組低于陰性組。由此可以推測，在臨床胃黏膜樣本中，H.pylori感染促進(jìn)DSB損傷后，MRE11作為HR修復(fù)的起始蛋白，表達(dá)會增多。但是，另一個(gè)HR修復(fù)的起始蛋白CtIP表達(dá)降低。而且作為HR修復(fù)的核心蛋白Rad51也同時(shí)降低。從而勢必影響HR修復(fù)開始階段DNA斷裂末端的剪切和后期DNA同源序列的尋找，影響HR修復(fù)的順利進(jìn)行。HR修復(fù)路徑的功能障礙必將造成DNA修復(fù)錯(cuò)誤率的增加，從而造成基因組的不穩(wěn)定性增加。

3.3研究意義與創(chuàng)新 既往在體外細(xì)胞系和原代細(xì)胞感染模型中研究表明，H.pylori感染可以抑制大部分DNA修復(fù)基因，包括MRE11[9]，但是在我們此次體內(nèi)臨床樣本研究中，卻發(fā)現(xiàn)H.pylori陽性的慢性胃炎患者胃黏膜中MRE11表達(dá)相對H.pylori陰性的上調(diào)，說明在體內(nèi)條件下可能有其他混雜因素參與調(diào)控MRE11。CtIP作為HR修復(fù)關(guān)鍵蛋白，既往未見有和H.pylori相關(guān)報(bào)道，此次是我們首次開創(chuàng)性的研究。我們發(fā)現(xiàn)在淺表性胃炎和腸化階段，H.pylori陽性患者的胃黏膜標(biāo)本中CtIP的表達(dá)較H.pylori陰性患者降低。CtIP作為HR修復(fù)重要起始蛋白和已知的抑癌蛋白[16]，其表達(dá)量的下降也將進(jìn)一步增加了細(xì)胞的癌變風(fēng)險(xiǎn)，也揭示了H.pylori致癌機(jī)制的一個(gè)新靶點(diǎn)，值得我們進(jìn)一步研究。因此，我們此次研究從臨床標(biāo)本層面證明，H.pylori可能是通過抑制CtIP和Rad51來抑制精確的HR修復(fù)路徑，從而開啟胃上皮細(xì)胞惡變的進(jìn)程。

3.4不足與展望 當(dāng)然，我們的研究也存在不足，比如樣本量還不夠豐富，這可能是沒有觀察到DNA損傷及修復(fù)蛋白在胃癌前期不同病理階段有明顯差別的原因，所以和以往某些相關(guān)研究有所差別。下一步，我們將增大樣本量，并進(jìn)一步分析H.pylori毒力菌株和毒力因子，以及相關(guān)的基因亞型與DNA損傷及HR修復(fù)蛋白的關(guān)系，探索H.pylori調(diào)控HR修復(fù)的具體機(jī)制，從而為臨床胃癌個(gè)體化和早期診斷，靶向治療提供理論基礎(chǔ)。

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