接種真菌對馬尾松幼苗抗銅性的影響

高 丙，黃 建，魯彥君

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 林學(xué)院，陜西 楊陵 712100)

銅礦區(qū)的生態(tài)修復(fù)及重金屬污染治理已經(jīng)成為一個日益突出的問題[1]。近年來研究表明，外生菌根真菌在礦區(qū)廢棄地植物修復(fù)與造林工程中潛力巨大。外生菌根及菌絲體既能改良土壤結(jié)構(gòu)[2]，又能促進水分與營養(yǎng)元素的吸收[3]，還能發(fā)揮“屏障”作用阻止重金屬離子向宿主植物地上部分轉(zhuǎn)運[4]，促進植物在重金屬污染的土壤中生長[5]。近年來的研究顯示，外生菌根除了直接調(diào)節(jié)宿主植物根系對水分與營養(yǎng)元素的吸收，還可以改善宿主植物響應(yīng)重金屬脅迫的光合系統(tǒng)、抗氧化系統(tǒng)以及植物激素等一系列生理響應(yīng)過程，提高宿主植物的解毒作用[6]。

因此，采用從銅礦區(qū)馬尾松菌根群落調(diào)查中分離的彩色豆馬勃中的一個抗銅性強的固體純培養(yǎng)菌株(Ptch)侵染馬尾松，研究菌根化馬尾松幼苗在銅脅迫條件下的生長、光合特性與抗氧化酶活性的變化規(guī)律，探討具有重金屬耐性的外生菌根真菌對宿主植物抗銅性的影響，為篩選與合理利用外生菌根菌修復(fù)銅礦區(qū)廢棄地提供試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 外生菌根真菌培養(yǎng)與菌劑制備

外生菌根真菌彩色豆馬勃用于侵染的菌株(Ptch)由本實驗室前期分離鑒定獲得，采用MMN培養(yǎng)基進行固體培養(yǎng)，培養(yǎng)時使用直徑為6 mm的打孔器將其切割轉(zhuǎn)移至含有MMN固體培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中，溫度25℃，相對濕度60%，暗培養(yǎng)4周，待菌絲布滿培養(yǎng)基后用于馬尾松接種。

1.2 馬尾松培養(yǎng)與接種

試驗樹種馬尾松(Pinusmassoniana)的種子由陜西省林業(yè)廳林業(yè)技術(shù)推廣總站提供。種子發(fā)芽處理采用馬瓊[7]等(2005)的方法，2015年12月，選取籽粒飽滿種子，流水沖洗，消毒，溫水浸種，置于25℃恒溫箱催芽，待30%～40%種子裂嘴露白時播種。種子播入孔穴盤(滅菌沙子)育苗，4周后挑選長勢一致的幼苗移栽。幼苗移栽在容量為1 L的花盆中，基質(zhì)為經(jīng)過高溫(121℃，滅菌2 h)滅菌的河沙與土(體積比為2∶1)，滅菌放置7 d后使用，共栽種250盆。

每個花盆移栽2株，同時進行接種，接種的方法參考劉藩[8](2015)，將培養(yǎng)基內(nèi)的固體培養(yǎng)基接種于花盆中，每盆接種4個菌餅，放在根系周圍，每月新接種一個菌餅，加入MMN營養(yǎng)液，盆栽幼苗放置在西北農(nóng)林科技大學(xué)溫室內(nèi)(25℃，光周期14 h光照/d，濕度70%)培養(yǎng)。6個月后，隨機選擇接菌與對照幼苗5株，用自來水沖洗根后，用顯微鏡觀察菌根的形成情況。

1.3 銅脅迫處理

將菌根化苗(M)與非菌根化苗(N)各70盆，各分為2組：一組對照，一組銅脅迫處理；在1/2 Hoagland營養(yǎng)液中加入CuSO4·5H2O(90 μmol·L-1)進行40 d處理，以每周30 μmol·L-1×1 L加入，累計3次終濃度達到90 μmol·L-1，非菌根化苗銅脅迫處理記為NCu，菌根化苗銅脅迫處理記為MCu，以1/2 Hoagland 營養(yǎng)液(含0.3 μmol·L-1CuSO4·5H2O)作為對照，非菌根化苗對照記為NC，菌根化苗對照記為MC。

1.4 菌根化苗的生理試驗

1.4.1 生長指標(biāo)測定 在銅脅迫處理結(jié)束時，隨機選取不同處理下的菌根化苗與非菌根化苗各5盆，用電子天平(精度0.000 1 g)稱量針葉、莖、根的鮮質(zhì)量(Fw)，后放入105℃烘箱殺青15 ～ 20 min，然后80℃烘干至恒重，測定干質(zhì)量(Dw)，并計算組織相對含水量(占鮮重%)=(Fw-Dw)/Fw×100%。

1.4.2 光合氣體交換參數(shù)與葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 應(yīng)用Li-6400(標(biāo)準(zhǔn)葉室2×3=6 cm2)便攜式光合測量系統(tǒng)(Li-Cor Inc.,Lincoln,Nebraska,USA)測定針葉的凈光合速率(Pn)、氣孔導(dǎo)度(Cond)、胞間CO2濃度(Ci)和蒸騰速率(Tr)。參數(shù)設(shè)置參照高瓊[9]等(2014)的方法，測定時間為晴天9:00-11:00，選取每株幼苗中部生長良好的的8片針葉作為測試葉，平鋪放置充滿葉室面積，待數(shù)據(jù)穩(wěn)定后取3個數(shù)據(jù)，取其平均值。

應(yīng)用脈沖調(diào)制式熒光系統(tǒng)(FMS-2型，英國Hansatech公司)，測定不同程度銅脅迫下幼苗針葉的葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)。參數(shù)設(shè)置與計算方法參照王琰[10]等(2011)的方法，選取每株幼苗中部生長良好的針葉8片，平鋪放置于葉室測定。試驗條件相對穩(wěn)定，氣溫(25±0.5)℃，空氣相對濕度(45±1)%。

1.4.3 抗氧化酶活性與丙二醛含量測定 采用氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性；采用愈創(chuàng)木酚顯色法測定過氧化物酶(POD)活性；采用紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性；丙二醛(MDA)含量的測定采用雙組分光光度法[11]。

1.4.4 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用SPSS(13.0)統(tǒng)計軟件處理，用單因素方差分析(oneway-ANOVA)檢驗不同濃度銅脅迫處理間的樣本數(shù)據(jù)結(jié)果的差異顯著性，采用Duncan(P<0.05)法進行顯著性多重比較，采用origin 9軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長適應(yīng)性

用Ptch接種馬尾松，共生6個月后形成典型的外生菌根結(jié)構(gòu)，通過隨機抽檢，發(fā)現(xiàn)侵染率約為60%。對照條件下，菌根化苗與非菌根化苗的莖、葉干重?zé)o明顯區(qū)別，但根干重比非菌根化苗高43.9%，根、莖、葉的相對含水量(RWC)比非菌根化苗高6.0%～14.0%(表1)。銅脅迫后，2種苗的干重與相對含水量均呈下降趨勢，非菌根化苗根、莖、葉干重與相對含水量分別下降了56.1%～75.8%和20.8%～44.7%，而菌根化苗下降了16.0%～48.4%與9.1%～27.6%。可見，銅脅迫明顯抑制非菌根化苗的生長，接種真菌增強了宿主植物的生長適應(yīng)性。

表1 銅脅迫對菌根化苗與非菌根化苗根、莖、葉干重與相對含水量的影響

注：每一個值(±SE)是5個樣本的重復(fù)，小寫字母表示不同處理間差異顯著(P<0.05)。下圖同。

2.2 光合氣體交換

菌根化苗與非菌根化苗顯示了不同的光合作用能力，對照條件下，菌根化苗凈光合速率(Pn)明顯高于非菌根化苗(高19.9%)，但氣孔導(dǎo)度(Cond)與蒸騰速率(Tr)比非菌根化苗低(32.9%與17.7%)，銅脅迫誘導(dǎo)2種苗的Pn、Cond與Tr有不同程度下降，但非菌根化苗下降幅度明顯大于菌根化苗，菌根化苗的Pn、Cond與Tr分別下降25.4%，56.0%與50.6%，非菌根化苗為38.9%，66.7%與70.8%(圖1A,B,C)。值得注意的是，銅脅迫誘導(dǎo)菌根化苗胞間CO2濃度(Ci)顯著下降38.4%(P<0.05)，而非菌根化苗并無明顯變化(圖1D)。

圖1 菌根化苗與非菌根化苗在銅脅迫下的光合速率，胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率的變化

2.3 葉綠素?zé)晒鈪?shù)

葉綠素?zé)晒猱a(chǎn)量為我們進一步獲得光化學(xué)與非光化學(xué)過程中的光合性能提供了有用的信息。銅脅迫下，非菌根化苗初始熒光(Fo)比對照有顯著升高(升高了31.0%)，最大熒光(Fm)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)、光化學(xué)淬滅(qP)、實際光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)以及光化學(xué)淬滅(NPQ)均較對照明顯下降，下降幅度在15.5%～39.7%，并且ΦPSⅡ的下降幅度大于Fv/Fm(圖2)，表明非菌根化苗的光抑制已經(jīng)產(chǎn)生。與非菌根化苗不同的是，菌根化苗在銅脅迫下Fo、Fv/Fm無明顯變化，F(xiàn)m、qP與ΦPSⅡ分別下降7.3%、30.5%與20.6%，NPQ卻增加了17.1%(圖2)，表明銅脅迫可增加菌根化苗針葉PSⅡ天線色素的熱耗散，在一定程度上緩解脅迫對光合作用的影響。

2.4 抗氧化酶活性與丙二醛

菌根化與非菌根化苗在銅脅迫下的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)與過氧化氫酶(CAT)以及丙二醛(MDA)含量顯示了不同的變化規(guī)律，對照條件下，菌根化苗與非菌根化苗的SOD、POD、CAT活性以及MDA含量均無明顯差異(P<0.05)，銅脅迫后，2種苗的SOD、POD以及CAT的活性均表現(xiàn)出升高趨勢，增加幅度分別是27.5%～176.5%與54.6%～108.9%(圖3)，表明銅脅迫誘導(dǎo)SOD、POD與CAT活性升高，保護光合作用機構(gòu)免受損傷。銅脅迫后，非菌根化苗MDA含量升高為對照的31.5%，菌根化苗MDA含量并無顯著變化，表明銅脅迫下，非菌根化苗針葉活性氧產(chǎn)生大于細胞活性氧清除能力。

圖2 Cu脅迫下菌根化苗與非菌根化苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的變化

圖3 銅脅迫下菌根化苗與非菌根化苗的超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)的活性與丙二醛(MDA)含量的變化

3 結(jié)論與討論

對接種了Ptch的馬尾松苗與未接種的馬尾松苗在銅脅迫處理條件下的生長與光合生理特性進行了比較，初步探索菌根在馬尾松苗抗銅脅迫中的作用。一般植物在脅迫條件下表現(xiàn)出明顯的生長(莖鮮重/干重，植物高度，葉面積以及葉數(shù)量等)抑制現(xiàn)象[12]，但本研究中菌根化苗相對非菌根化苗依然維持了較高的根系生長量(表1)，對于植物在脅迫條件下吸收水分與營養(yǎng)元素至關(guān)重要[13]。維持較高的相對含水量(RWC)有助于植物正常生理生化反應(yīng)過程的進行[13]。菌根化苗各器官在對照條件下保持了較高RWC，銅脅迫雖誘導(dǎo)其下降，但下降程度明顯小于非菌根化苗，說明接種真菌有助于宿主植物水分吸收，從而維持正常生理過程。

植物生物量積累與光合作用密切相關(guān)[14]。銅脅迫誘導(dǎo)菌根化苗與非菌根化苗的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導(dǎo)度(Gs)隨之下降，并且菌根化苗下降程度低于非菌根化苗，說明菌根結(jié)構(gòu)可以在銅脅迫條件下提高馬尾松苗的光合作用能力，有利于其生物量的積累。通常影響植物光合作用的因素可分為氣孔因素和非氣孔因素，前者是水分脅迫導(dǎo)致氣孔導(dǎo)度減小，阻礙CO2進入葉片使光合下降；后者由于葉肉細胞的光合活性下降使凈光合速率下降[15]。結(jié)合非菌根化苗在銅脅迫下的Gs下降幅度遠大于菌根化苗，Ci卻沒有明顯降低，推測其Pn降低的原因由非氣孔因素造成，銅脅迫會導(dǎo)致葉肉光合活性下降，而菌根結(jié)構(gòu)對葉肉光合活性具有一定保護作用。

葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)手段，能快速靈敏、無損傷地反映“內(nèi)在的”光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)對光能的吸收、傳遞、耗散、分配等方面的狀況，是進一步證明植物光合能力以及對環(huán)境脅迫響應(yīng)的有效手段[16]。非菌根化苗的Fo顯著升高，F(xiàn)m、Fv/Fm、ΦPSⅡ以及NPQ都顯著下降(圖 2)，表明光系統(tǒng)受到一定程度損傷，熱耗散受抑制，光抑制增加，由此推測，非菌根化苗光系統(tǒng)PSⅡ的損傷是Pn下降的非氣孔限制的可能原因，因為一定程度的脅迫可以使松樹針葉的PSⅡ活性中心受損[17]；而菌根化苗的PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率(ΦPSⅡ)與光化學(xué)猝滅(qP)均顯著降低，但程度小于非菌根化苗，最大熒光(Fm)、最大光化學(xué)效率(Fv/Fm)與初始熒光(Fo)并未發(fā)生顯著變化，但非光化學(xué)猝滅(NPQ)卻顯著升高，表明菌根化苗在銅脅迫下啟動了光響應(yīng)防御機制，天線色素捕獲的光能向PSⅡ反應(yīng)中心傳遞的效率下降，熱耗散能力有一定增加，減少了反應(yīng)中心過剩光能的積累，保護了光合機構(gòu)免受破壞[16]。

銅脅迫很容易引起植物氧化損傷，產(chǎn)生過量活性氧，作用于許多細胞組分，造成細胞組分破壞[18]。銅脅迫誘導(dǎo)菌根化與非菌根化苗的抗氧化酶活性(SOD、POD與CAT)升高，說明馬尾松苗針葉PSⅡ的熱耗散和酶活性協(xié)調(diào)發(fā)揮作用，維持光合結(jié)構(gòu)的正常功能。但菌根化苗抗氧化酶活性增幅大于非菌根化苗，MDA增幅則遠小于非菌根化苗，表明Ptch可提高馬尾松苗在銅脅迫下的抗氧化酶活性，減少光合系統(tǒng)損傷，降低光抑制程度，保持較為穩(wěn)定的凈光合速率，增加菌根化苗生物量的積累，有助于提高馬尾松苗的抗銅性。

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