姜黃素對慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響

張 明，唐晶晶，謝穎穎，張 潔，張秋紅，楊 俠，單 虎，李雅莉

(西安交通大學第二附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學科，陜西西安 710004)

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)是一種具有氣流受限特征的肺部疾病，氣流受限不完全可逆，呈進行性發(fā)展。COPD全球倡議2017指出，COPD位列所有疾病死亡原因的第4位，預(yù)計到2020年將成為死亡原因第3位[1]。目前，由于暴露于COPD的危險因素仍然在繼續(xù)增加，加之人口老齡化上升趨勢，COPD的疾病負擔在未來幾十年內(nèi)仍將持續(xù)加劇。因此，探索COPD的發(fā)病機制并采取有效的防治措施已是臨床研究的重大課題。盡管炎癥反應(yīng)和過氧化應(yīng)激是COPD的主要發(fā)病機制[2]，但近年來研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在COPD發(fā)病中具有重要作用[3]。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激有利于細胞恢復內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和維持存活，但持續(xù)或高強度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激則會導致細胞凋亡，從而進一步加重COPD發(fā)病[3]。

姜黃素是一種從姜科、天南星科等植物的根莖中提取到的黃色色素，為酸性多酚類物質(zhì)，是日常生活中常用的色素及食品調(diào)味添加劑[4]。大量的科學研究表明，姜黃素藥理作用廣泛，具有抗氧化、抗炎、抗纖維化、抗病毒等生物學特性[5-6]。新近研究發(fā)現(xiàn)，長期食用富含姜黃素的咖喱可顯著改善亞洲老年人的肺功能狀態(tài)，對吸煙誘導的肺功能損傷起保護作用[7]。然而，有關(guān)姜黃素對COPD的作用及其分子機制尚不完全清楚。本研究將觀察姜黃素對COPD大鼠肺泡上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的影響，進而探索姜黃素對COPD的可能作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物及試劑健康清潔級雄性SD大鼠38只，體質(zhì)量(150±15)g，購于西安交通大學實驗動物中心；適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機分為以下4組：正常對照組(n=9)、COPD模型組(n=9)、姜黃素干預(yù)組(n=10)和溶劑對照組(n=10)。脂多糖、姜黃素和羧甲基纖維素鈉均購自Sigma公司；七匹狼香煙(焦油含量10 mg，煙氣煙堿量0.8 mg，煙氣一氧化碳量12 mg)由福建中煙工業(yè)有限責任公司生產(chǎn)；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78, GRP78)購自Cell Signaling Technology；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔二抗和DAB顯色劑購自武漢博士德生物工程有限公司。

1.2COPD大鼠模型的建立及干預(yù)參照經(jīng)典的煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)注射脂多糖的方法建立COPD大鼠模型[8-9]：于第1、15天氣管內(nèi)注入1 mg/mL脂多糖0.2 mL，第2～14、第16～60天將大鼠置于38 cm×46 cm×63 cm的透明密閉容器內(nèi)煙熏，6支/次，30 min/次，2次/d。于第31天起，正常對照組和COPD模型組大鼠予以3 mL生理鹽水灌胃，1次/d，共30 d；姜黃素干預(yù)組予以3 mL姜黃素/羧甲基纖維素鈉溶液灌胃(100 mg/kg)，1次/d，共30 d；溶劑對照組予以3 mL羧甲基纖維素鈉溶液灌胃，1次/d，共30 d。于第61天稱取所有大鼠體質(zhì)量，之后進行以下操作。

1.3支氣管肺泡灌洗液中細胞計數(shù)通過氣管插管術(shù)收集肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid, BALF)，分3次緩慢注入4 ℃冷PBS液，每次3 mL，緩慢收集，回收液為80%左右。BALF于4 ℃下1 500 r/min離心10 min，之后用1 mL PBS液重懸細胞沉淀，血細胞計數(shù)板進行細胞計數(shù)，并經(jīng)Wright染色對中性粒細胞和巨噬細胞進行分類計數(shù)。

1.4肺組織病理學觀察取右肺上葉最大直徑組織條，40 g/L多聚甲醛固定過夜，常規(guī)石蠟包埋切片，HE染色，光鏡下觀察各組標本組織病理學改變。

1.5肺組織電鏡觀察取右肺上葉近肺門處組織，剪成1 mm3大小，經(jīng)25 g/L戊二醛固定、PBS漂洗、乙醇和丙酮梯度脫水后，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片機以60 nm厚度切片，再經(jīng)醋酸鈾和檸檬酸鉛雙重染色后于透射電子顯微鏡(H-7650，日本日立)下觀察肺泡上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)損傷情況并拍照。

1.6免疫組織化學染色參照試劑盒推薦的鏈酶抗生物素蛋白-過氧化酶(SP)法進行操作。將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)酶修復、非特異性抗原封閉后，滴加兔抗大鼠GRP78抗體稀釋液(1∶100)，存放于4 ℃冰箱內(nèi)過夜；PBS洗滌后滴加適量生物素化的二抗，于37 ℃下孵育30 min；滴加SABC，37 ℃孵育30 min；DAB顯色，自來水充分沖洗終止反應(yīng)，蘇木精復染，脫水、透明及樹脂封片。陽性表達為細胞質(zhì)呈棕黃色顆粒狀改變，并采用Image Pro-Plus6.0圖像分析軟件定量分析GRP78在肺泡上皮細胞中的表達水平。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠的一般情況正常對照組大鼠一般情況較好，毛發(fā)光亮有色澤，食欲佳，打斗好動，對驅(qū)趕反應(yīng)敏捷；COPD模型組和溶劑對照組大鼠逐漸表現(xiàn)出蜷縮成團，相互靠攏依偎，不喜活動，毛發(fā)枯黃、無光澤，食欲下降，呼吸淺快，有間斷咳嗽，可聞及喘息，口鼻周圍有漿液性分泌物，對驅(qū)趕反應(yīng)遲鈍；姜黃素干預(yù)組大鼠精神狀態(tài)欠佳，毛發(fā)亮澤，食欲尚可，對驅(qū)趕反應(yīng)稍遲鈍，咳嗽、氣喘癥狀較模型組明顯改善。至實驗結(jié)束共有4只大鼠死亡，其中COPD模型組1只，姜黃素干預(yù)組1只，溶劑對照組2只；其死亡原因可能系呼吸衰竭、肺水腫或灌胃操作所致。

2.2姜黃素對大鼠BALF中細胞計數(shù)的影響與正常對照組相比，COPD模型組大鼠BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞及巨噬細胞數(shù)量均顯著升高(P<0.05)；姜黃素干預(yù)組大鼠BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞及巨噬細胞數(shù)量較COPD模型組均顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞及巨噬細胞數(shù)量在溶劑對照組與COPD模型組之間比較無統(tǒng)計學差異(P>0.05，圖1)。

圖1各組大鼠BALF中細胞總數(shù)、中性粒細胞和巨噬細胞的比較

與正常對照組相比，*P<0.05；與COPD模型組相比，#P<0.05。

2.3姜黃素對大鼠肺組織形態(tài)學的影響組織病理學研究顯示，正常對照組大鼠肺組織結(jié)構(gòu)正常，肺泡腔及小氣道周圍未見炎癥細胞浸潤；COPD模型組和溶劑對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡腔擴張或融合形成肺大皰，毛細血管床減少，小氣道周圍大量炎癥細胞浸潤，局部纖毛脫落；姜黃素干預(yù)組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)相對較完整，肺泡腔輕度擴大，小氣道周圍炎癥細胞浸潤較模型組明顯減輕(圖2)。

圖2各組大鼠肺組織病理學的改變

Fig.2 Pathological changes of rat lung tissues (×200)

A：正常對照組；B：COPD模型組；C：姜黃素干預(yù)組；D：溶劑對照組。

2.4姜黃素對大鼠肺泡上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)形態(tài)的影響透射電子顯微鏡下可見：正常對照組大鼠肺泡上皮細胞結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分布均勻，排列整齊；COPD模型組和溶劑對照組大鼠肺泡上皮細胞結(jié)構(gòu)不完整，細胞基底膜增厚，并可觀察到彈力纖維、膠原纖維增生，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)不規(guī)則擴張、扭曲及腫脹；姜黃素干預(yù)組大鼠肺泡上皮細胞結(jié)構(gòu)較模型組完整，膠原纖維增生減少，基底膜稍增厚，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度扭曲及腫脹(圖3)。

2.5姜黃素下調(diào)COPD大鼠肺泡上皮細胞中GRP78的表達免疫組織化學結(jié)果顯示，GRP78在4組大鼠肺泡上皮細胞均有表達(圖4)。采用Image Pro-Plus6.0圖像分析軟件定量分析顯示，COPD模型組大鼠肺泡上皮細胞中GRP78表達較正常對照組顯著升高(P<0.05)；姜黃素干預(yù)后COPD大鼠肺泡上皮細胞中GRP78表達水平降低，與COPD模型組比較有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；GRP78在溶劑對照組與COPD模型組大鼠肺泡上皮細胞中的表達水平無統(tǒng)計學差異(P>0.05)。

圖3各組大鼠肺泡上皮細胞超微結(jié)構(gòu)的變化

Fig.3 Ultrastructural changes of rat alveolar epithelial cells (×30 000)

A：正常對照組，B：COPD模型組，C：姜黃素干預(yù)組，D：溶劑對照組。箭頭示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。

圖4 姜黃素下調(diào)COPD大鼠肺泡上皮細胞中GRP78的表達Fig．4Curcumindown?regulatedGRP78expressioninthealveolarepitheliaofCOPDrats(×400)A～D：正常對照組、COPD模型組、姜黃素干預(yù)組、溶劑對照組；E：GRP78在各組大鼠肺泡上皮細胞中表達水平(x±s)。與正常對照組相比，?P<0．05；與COPD模型組相比，#P<0．05。

3 討 論

COPD的確切病因及發(fā)病機制迄今仍不清楚，但全身及肺部炎癥反應(yīng)在本病的發(fā)病中起重要作用。全身炎癥反應(yīng)強度與COPD患者肺功能呈負相關(guān)[10]，且已有多種系統(tǒng)性炎癥指標用于預(yù)測COPD急性加重頻率及其預(yù)后[11]。COPD的肺部炎癥反應(yīng)表現(xiàn)為中性粒細胞、巨噬細胞、淋巴細胞等多種炎癥細胞對各級支氣管系統(tǒng)的浸潤，而聚集在支氣管周圍的炎癥細胞可釋放大量炎癥因子，趨化更多炎癥細胞聚集，加重氣道炎癥反應(yīng)。因此，計數(shù)BALF中炎癥細胞數(shù)量可間接評估COPD嚴重程度。本研究參照既往的研究方法[8-9]，應(yīng)用香煙煙熏聯(lián)合氣管內(nèi)注射脂多糖的方法建立COPD大鼠模型，結(jié)果表明COPD大鼠BALF中存在大量中性粒細胞和巨噬細胞，與既往文獻報道一致[12]。進一步的肺組織病理學研究顯示，COPD模型組大鼠存在小氣道周圍炎癥反應(yīng)及肺泡腔擴張，符合人類COPD病理學特征[13]。因此，應(yīng)用此方法可成功建立COPD大鼠模型。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細胞內(nèi)的一個重要細胞器，主要負責蛋白質(zhì)的合成、加工和轉(zhuǎn)運，此外它還具有感知應(yīng)激的功能。缺氧、過氧化應(yīng)激、葡萄糖/營養(yǎng)物質(zhì)匱乏、ATP耗竭等因素均可擾亂內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能，導致大量未折疊或錯誤折疊蛋白在腔內(nèi)堆積，導致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[14]。真核細胞存在3種主要的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器蛋白(蛋白激酶R樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶、肌醇需求酶1和活化轉(zhuǎn)錄因子6)，與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)的GRP78結(jié)合而處于無活性狀態(tài)。當內(nèi)質(zhì)網(wǎng)受到應(yīng)激時，GRP78表達上調(diào)，并與上述3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激傳感器蛋白解離，同未折疊或錯誤折疊的蛋白相結(jié)合，減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，故而GRP78是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的主要標志性蛋白分子[15]。通過檢測細胞內(nèi)GRP78表達水平或電鏡觀察內(nèi)質(zhì)網(wǎng)超微結(jié)構(gòu)可用于判斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的應(yīng)激狀態(tài)。本研究我們通過透射電子顯微鏡觀察，可見COPD大鼠肺泡上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)管腔擴張及扭曲；免疫組織化學顯示GRP78在COPD大鼠肺泡上皮細胞中表達水平顯著上調(diào)，提示COPD肺泡上皮細胞存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，過度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可激活肺泡上皮細胞內(nèi)凋亡通路，參與COPD發(fā)病。

姜黃素是目前世界上銷量最大的天然食用色素之一，具有顯著的抗炎、抗氧化等藥理學作用，并廣泛用于動脈粥樣硬化、腫瘤、糖尿病和類風濕性關(guān)節(jié)炎等疾病的防治[6]。近年研究又發(fā)現(xiàn)，姜黃素亦可通過調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮其藥理學特性。譬如姜黃素通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的活化，對非酒精性肝炎小鼠的腎功能發(fā)揮保護作用[16]；還可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導的細胞凋亡通路，減輕糖尿病大鼠睪丸損傷[17]。又有文獻報道，姜黃素可能通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中JNK信號轉(zhuǎn)導通路的過度活化來拮抗肺缺血再灌注損傷[18]。然而姜黃素對COPD肺泡上皮細胞及其內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的影響，迄今鮮有文獻報道。本研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可抑制COPD大鼠BALF中炎癥細胞浸潤，且可改善肺泡上皮細胞損傷及氣道炎癥程度，提示姜黃素對COPD起保護作用。進一步研究表明，姜黃素可減輕COPD肺泡上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張，以及下調(diào)GRP78在肺泡上皮細胞中表達水平。因此，姜黃素可能通過抑制肺泡上皮細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激狀態(tài)，發(fā)揮對COPD保護作用。本研究結(jié)果為進一步探討姜黃素對COPD的治療作用提供有益數(shù)據(jù)。

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