氯沙坦對百草枯中毒致大鼠急性腎損傷的保護(hù)作用

喻 莉 ，張劍鋒 ，李 霽 ，葉 喆

百草枯是一種有效且廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)的觸滅型除草劑，其中毒易導(dǎo)致多組織器官衰竭，最為常見的靶器官為肺臟和腎臟，其中約50%的中毒患者出現(xiàn)急性腎損傷（acute kidney injury，AKI）[1]。如何防治百草枯中毒導(dǎo)致的AKI是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)之一。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，百草枯腎損傷后出現(xiàn)核因子κB（nuclear factor κB，NF-κB）和白介素-6（interleukin-6，IL-6）升高[2]，證實(shí)過度炎性反應(yīng)參與了百草枯腎損傷。文獻(xiàn)[3]研究表明，血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑氯沙坦，可降低炎性因子的表達(dá)，從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞免受損傷。氯沙坦是否對百草枯中毒致AKI具有保護(hù)作用，目前尚無相關(guān)報道。本研究擬建立百草枯灌胃誘導(dǎo)大鼠AKI模型，觀察應(yīng)用氯沙坦干預(yù)后，對腎組織腫瘤壞死因子 -α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、IL-6及NF-κB蛋白表達(dá)的影響，以探究氯沙坦對百草枯中毒大鼠AKI的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 健康成年雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬祝⊿prague-Dawley，SD）大鼠54只，無特定病原體（specific pathogen free，SPF）級，體質(zhì)量 200～250 g，由廣西醫(yī)科大學(xué)動物中心提供，動物使用許可證：SYXK桂2014-0003。飼養(yǎng)溫度（20±2） ℃，自由進(jìn)水，普通飼料喂養(yǎng)。

1.2 主要試劑、藥品和儀器 二氯百草枯結(jié)晶體（Sigma公司，美國），氯沙坦鉀片（默沙東公司，美國），兔抗大鼠NF-κB抗體（CST公司，美國），兔抗大鼠IL-6抗體（abcam公司，美國），兔抗大鼠TNF-α抗體（GeneTeX公司，美國），辣根過氧化物酶山羊抗兔IgG（Milipore公司，美國）。病理圖像分析系統(tǒng)（Leica 公司，德國）。

1.3 方法

1.3.1 模型制作與分組 將54只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字法分成3組，其中生理鹽水對照組（NS組）18只，百草枯模型組（PQ組）18只，氯沙坦干預(yù)組（LT組）18只。PQ組和LT組均給予100 mg/kg的百草枯一次性灌胃；NS組給予大鼠與百草枯等量的生理鹽水灌胃。LT組在灌胃后立即給予60 mg/kg的氯沙坦繼續(xù)灌胃，并每24 h重復(fù)給予氯沙坦一次，分別于灌胃后1 d、3 d、7 d后處死并留取標(biāo)本，本實(shí)驗(yàn)動物處置方法符合動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.2 標(biāo)本采集 10%水合氯醛以0.03 ml/kg進(jìn)行腹腔注射麻醉，4%多聚甲醛固定左腎48 h，脫水、浸蠟、包埋、切片，行蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining，HE）、免疫組織化學(xué)染色。

1.3.3 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 取左腎組織經(jīng)固定、脫水、透明及包埋后切片、HE染色，樹脂封片，光鏡下觀察腎臟組織病理學(xué)改變[4]。AKI造模成功評定標(biāo)準(zhǔn)為光鏡下觀察腎組織病理出現(xiàn)典型的急性腎小管壞死。

1.3.4 免疫組織化學(xué)染色觀察 采用免疫組織化學(xué)法評估腎組織TNF-α、IL-6及NF-κB蛋白的表達(dá)，依次通過切片、脫蠟、水化、抗原修復(fù)后，加血清封閉液孵育，滴加一抗（NF-κB抗體1∶800，TNF-α抗體1∶400，IL-6抗體1∶500）過夜，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）沖洗，加入二抗孵育，PBS沖洗，二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色肉眼看到棕色立即終止染色，透明及封片，光學(xué)顯微鏡下觀察陽性細(xì)胞，每張切片在400倍鏡下隨機(jī)選擇5個視野計數(shù)，取其平均值并做統(tǒng)計判斷。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，正態(tài)分布計量資料以表示，不同時間點(diǎn)TNF-α、IL-6及NF-κB水平比較采用重復(fù)測量方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以雙側(cè)P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 大鼠基本情況 NS組大鼠表現(xiàn)為：食欲、呼吸正常，精神狀況良好，行動靈活。PQ組大鼠多在染毒后2 h內(nèi)即可出現(xiàn)中毒癥狀，表現(xiàn)為倦怠、煩躁、進(jìn)食進(jìn)水量不同程度減少、口鼻見血性分泌物、毛發(fā)蓬松，動作遲緩易捕捉等。LT組大鼠也出現(xiàn)上述中毒反應(yīng)，但較PQ組輕。

2.2 腎組織形態(tài)學(xué)觀察 NS組光鏡下觀察可見腎小管、腎小球結(jié)構(gòu)清晰，腎間質(zhì)及血管周圍無充血、無炎性細(xì)胞浸潤（圖1A、圖1D）。PQ組于染毒后2 h內(nèi)即可觀察到腎間質(zhì)不同程度充血、水腫，可伴炎性細(xì)胞浸潤，腎小球內(nèi)開始出現(xiàn)紅細(xì)胞增多；中毒后第3天可觀察到腎小管上皮細(xì)胞大片空泡樣變性、炎性細(xì)胞浸潤，腎小球內(nèi)也可見淋巴細(xì)胞浸潤，管腔輕度狹窄，偶出現(xiàn)上皮細(xì)胞脫落壞死（圖1B）；第7天腎小管空泡樣變性較第3天組稍減少，炎性細(xì)胞浸潤，出現(xiàn)部分脫落壞死細(xì)胞，管腔狹窄（圖1E）。LT組用藥干預(yù)后第1天、第3天（圖1C）仍有不同程度充血水腫、炎性細(xì)胞浸潤及腎小管空泡樣變性，但較PQ組輕；干預(yù)后第7天腎上皮細(xì)胞輕度水腫，脫落細(xì)胞數(shù)減少，腎小管輕度空泡樣變性，部分淋巴細(xì)胞浸潤（圖1F）。

2.3 TNF-α、IL-6及NF-κB免疫組化

圖1 大鼠腎組織結(jié)構(gòu)變化（HE，×200）

2.3.1 大鼠腎組織NF-κB蛋白表達(dá) 重復(fù)測量分析結(jié)果顯示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差協(xié)方差矩陣滿足H型條件（P=0.736）。不同時間點(diǎn)的大鼠NF-κB蛋白表達(dá)量均值之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=8.551，P=0.001），分組與時間有交互作用（F=22.740，P＜0.001）。組間比較：PQ組和LT組各時間點(diǎn)大鼠NF-κB表達(dá)均高于NS組（P＜0.05）；LT組與PQ組比較， NF-κB在第1天無明顯差異，但在第3天LT組明顯降低并持續(xù)至第7天（P＜0.05）。組內(nèi)比較：NS組各時間點(diǎn)NF-κB蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.429，P=0.270）；PQ組大鼠NF-κB表達(dá)至第3天達(dá)高峰，隨后逐漸下降；LT組3 d間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1、圖2。

2.3.2 大鼠腎組織TNF-α蛋白表達(dá) 重復(fù)測量分析結(jié)果顯示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差協(xié)方差矩陣滿足H型條件（P=0.101）。不同時間點(diǎn)的大鼠TNF-α蛋白表達(dá)量均值之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=12.193，P＜0.001），分組與時間有交互作用（F=21.335，P＜0.001）。組間比較：PQ組和LT組各時間點(diǎn)大鼠TNF-α表達(dá)均高于NS組（P＜0.05）；LT組與PQ組比較，TNF-α在第1天無明顯差異，但在第3天LT組明顯降低并持續(xù)至第7天（P＜0.05）。組內(nèi)比較：NS組各時間點(diǎn)TNF-α蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F=0.012，P=0.989）；PQ組大鼠TNF-α表達(dá)至第3天達(dá)高峰，隨后逐漸下降；LT組3 d間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1、圖3。

2.3.3 大鼠腎組織IL-6蛋白表達(dá) 重復(fù)測量分析結(jié)果顯示，重復(fù)測量數(shù)據(jù)的方差協(xié)方差矩陣滿足H型條件（P=0.695）。不同時間點(diǎn)的大鼠IL-6蛋白表達(dá)量均值之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（F=53.419，P＜0.001），分組與時間有交互作用（F=13.573，P＜0.001）。組間比較：PQ組和LT組各時間點(diǎn)大鼠IL-6表達(dá)均高于NS組（P＜0.05）； LT組各時間點(diǎn)IL-6蛋白表達(dá)水平均低于PQ組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。組內(nèi)比較：NS組各時間點(diǎn)IL-6蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（F=1.662，P=0.223），PQ組大鼠IL-6在第1天表達(dá)即明顯升高，后緩慢下降；LT組3 d間差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。見表1、圖4。

表1 各組大鼠 NF-κB 、TNF-α與IL-6蛋白表達(dá)水平比較

表1 各組大鼠 NF-κB 、TNF-α與IL-6蛋白表達(dá)水平比較

注：NF-κB，核因子κB；TNF-α，腫瘤壞死因子-α；IL-6，白介素-6；NS組為生理鹽水對照組；PQ組為百草枯模型組；LT組為氯沙坦干預(yù)組；與NS組同時間點(diǎn)比較，①P＜0.05；與PQ組同時間點(diǎn)比較，②P＜0.05；與同組第1天比較，③P＜0.05；與同組第3天比較，④P＜0.05

指標(biāo) 只數(shù) NS組 PQ組 LT組NF-κB第1天 6 5.67±3.67 70.00±9.48① 70.83±13.57①第3天 6 3.50±1.76 95.83±4.91①③ 51.67±16.33①②③第7天 6 6.33±3.32 84.17±6.64① 29.17±5.84①②③TNF-α第1天 6 3.50±2.07 71.67±12.11① 78.33±8.16①第3天 6 3.50±2.51 95.00±3.16①③ 63.33±16.33①②③第7天 6 3.67±1.96 85.00±6.32① 40.67±35.09①②③④IL-6第1天 6 4.50±2.34 94.17±5.84① 64.17±4.91①②第3天 6 2.83±1.47 85.83±3.76①③ 50.83±8.01①②③第7天 6 2.67±1.86 73.33±8.75① 29.17±3.76①②③④

圖2 大鼠腎臟NF-κB蛋白質(zhì)表達(dá)水平（IHC，×400）

3 討 論

急性百草枯中毒易導(dǎo)致多個器官功能損傷，主要的靶器官之一是腎臟。腎臟是人體最大、最主要的排泄器官，百草枯中毒后，大部分毒物通過腎臟排泄，其余部分則重吸收進(jìn)入血液循環(huán)，通過腎臟的二次排泄清除，如此循環(huán)，對腎臟造成嚴(yán)重?fù)p傷，而腎損傷又是影響百草枯中毒患者預(yù)后的重要因素之一[5]。百草枯中毒造成的腎臟損傷包括早期的炎性細(xì)胞大量浸潤，腎小管上皮細(xì)胞充血水腫至腎小管脫落壞死，嚴(yán)重時可致急性腎功能壞死，進(jìn)而造成不可逆性損傷，最終導(dǎo)致腎衰竭。但是其具體機(jī)制尚未完全闡明，細(xì)胞凋亡、氧自由基損傷、炎性因子及細(xì)胞因子的網(wǎng)絡(luò)激活、腎臟血流動力學(xué)改變及毒物本身的影響等諸多因素均可能參與其中，而過度炎性反應(yīng)與氧化應(yīng)激可能占據(jù)重要地位[6]。

本實(shí)驗(yàn)以100 mg/kg百草枯的劑量一次性經(jīng)口灌胃建立急性百草枯中毒大鼠模型。染毒后，PQ組大鼠腎臟組織中TNF-α、IL-6及NF-κB蛋白表達(dá)顯著升高，其中TNF-α、NF-κB的蛋白表達(dá)量均在第3天達(dá)到峰值，并且伴隨炎性因子的表達(dá)升高，腎組織病理損傷加重，出現(xiàn)大片的空泡變性、壞死。而后緩慢下降，至第7天大鼠腎組織TNF-α、IL-6及NF-κB蛋白表達(dá)量仍高于正常生理鹽水對照組。提示IL-6、TNF-α、NF-κB三者均參與百草枯致腎損傷的過程，其中IL-6表達(dá)水平與炎性損傷程度呈正相關(guān)。

圖3 大鼠腎臟TNF-α蛋白質(zhì)表達(dá)水平 （IHC，×400）

有研究者發(fā)現(xiàn)，NF-κB家族是由多個具有高度同源性的多肽組合而成的，其中包括5個亞單位：p65、c-Rel、p525、p50和 RelB[7]。在靜息狀態(tài)下，主要以無活性復(fù)合體的潛在狀態(tài)形式存在于胞漿中。當(dāng)病毒感染、脫氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）受損及TNF-α等外界因素刺激后，IκB激酶復(fù)合體自身活化將IκB磷酸化而后被泛素－蛋白酶體系統(tǒng)（ubiquitinproteasome system, UPS）所降解，暴露出NF-κB亞基上的轉(zhuǎn)運(yùn)信號和DNA位點(diǎn)，進(jìn)而使游離的NF-κB核內(nèi)移，與靶基因NF-κB結(jié)合位點(diǎn)緊密結(jié)合，進(jìn)一步誘導(dǎo)靶基因信使核糖核酸（message ribonucleic acid，mRNA）及相應(yīng)蛋白質(zhì)的迅速合成及分泌[8]。NF-κB作為一種多效轉(zhuǎn)錄因子，在基因?qū)用鎲影═NF-α、IL-6、IL-8等炎性因子和炎性介質(zhì)的表達(dá)，參與細(xì)胞免疫應(yīng)答、抗感染、組織損傷修復(fù)和局部組織炎性反應(yīng)等不同的病理生理全過程。TNF-α是由活化的單核－吞噬細(xì)胞產(chǎn)生并分泌，是百草枯中毒致急性炎性反應(yīng)的始動因子和樞紐因子，通過激活NF-κB與其他細(xì)胞因子構(gòu)成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，發(fā)生一系列的連鎖反應(yīng)，引起全身炎性反應(yīng)綜合征，對腎臟產(chǎn)生潛在的損害作用[9]。NF-κB信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑又是TNF-α發(fā)揮功能的關(guān)鍵通路之一，其發(fā)揮作用是通過TNF-α與細(xì)胞膜表面的TNF受體發(fā)生特異性結(jié)合，引起TNF受體死亡蛋白（TNF receptor-associated death domain protein，TRADD）的激活和增加，活化的TRADD又可與TNF受體偶聯(lián)因子2（TNF receptor-associated factor 2，TRAF2）結(jié)合并迅速激活NIK，IκBα發(fā)生磷酸化繼而激活NF-κB途徑，使其繼續(xù)產(chǎn)生相關(guān)連鎖反應(yīng)[10]。研究者們也證實(shí)了百草枯中毒導(dǎo)致腎損傷的過程中，腎組織TNF-α濃度隨時間的增加而升高，TNF-α的濃度尤其在NF-κB表達(dá)后顯著升高，且在時間上與腎組織病理損害程度相關(guān)[11]。

圖4 大鼠腎臟IL-6蛋白質(zhì)表達(dá)水平 （IHC，×400）

氯沙坦是血管緊張素Ⅱ1型受體（angiotensinⅡtype1 receptor，AT1R）拮抗劑，可選擇性地作用于AT1R，從內(nèi)源性和外源性兩方面阻斷血管緊張素Ⅱ（angiotensinⅡ，AngⅡ）所產(chǎn)生的各種不同的生理反應(yīng)。AngⅡ通過與AT1R結(jié)合，參與調(diào)控炎性、細(xì)胞增生及纖維化等反應(yīng)，導(dǎo)致血管通透性增加，炎性細(xì)胞募集在腎臟，多形核白細(xì)胞活化，以及上調(diào)黏附分子、趨化因子和細(xì)胞因子水平，最終導(dǎo)致腎損害[12,13]?？梢姡珹ngⅡ可能與百草枯所致的AKI乃至多臟器功能障礙有關(guān)。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)氯沙坦可通過阻斷AngⅡ介導(dǎo)的球管反饋移動，減弱AngⅡ參與腎的自我調(diào)節(jié)的次級機(jī)制[14]，從而增加遠(yuǎn)端腎單位體積和鈉的排出。Milan等[15]發(fā)現(xiàn)AT1R拮抗劑氯沙坦可降低高血壓患者的腎小管損傷程度，且在高血壓患者缺血性急性腎功能衰竭發(fā)作期間無特別的腎功能惡化風(fēng)險。文獻(xiàn)[16-18]報道，氯沙坦可通過提高肺組織的抗氧化能力和降低NF-κB mRNA表達(dá)從而發(fā)揮對肺組織的保護(hù)作用。

本研究應(yīng)用氯沙坦干預(yù)百草枯中毒大鼠腎損傷模型，發(fā)現(xiàn)腎組織TNF-α、IL-6及NF-κB蛋白表達(dá)量較中毒模型組下降，且隨時間的推移，下降越明顯。氯沙坦1 d干預(yù)組的蛋白表達(dá)量較中毒模型組下降不明顯，3 d、7 d干預(yù)組蛋白表達(dá)量相對于中毒模型組下降較明顯，提示該藥物對百草枯中毒致AKI可能具有一定程度的保護(hù)作用，但其具體保護(hù)作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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