利拉魯肽對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞牽張損傷的神經(jīng)保護(hù)作用

李建鑫，朱曉龍，蘇景良，李建偉，梁海乾，孫洪濤

(中國(guó)人民武裝警察部隊(duì)后勤學(xué)院附屬醫(yī)院腦科中心，天津 300162)

顱腦創(chuàng)傷(TBI)具有發(fā)病急驟，高致死率和高致殘率的特點(diǎn)。為更好研究TBI的發(fā)病機(jī)制及治療方案，涌現(xiàn)出了許多體外損傷模型[1]。神經(jīng)牽張損傷體外模型可以準(zhǔn)確的模擬TBI后的細(xì)胞改變，為我們更精確的研究神經(jīng)損傷的機(jī)制以及并探索可能的治療方案。近年來(lái)，有研究[2]顯示，某些肽類激素，在大量的基礎(chǔ)研究中表現(xiàn)出神經(jīng)保護(hù)性潛能。因此，外源性的給予這些天然肽類激素作為治療性藥物治療神經(jīng)損傷可能是潛在的治療新策略。胰高血糖素已被證實(shí)具備神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)和神經(jīng)保護(hù)特性。胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)及受體在人體分布廣泛且療效多樣。除治療糖尿病外，GLP-1 受體激動(dòng)劑在神經(jīng)系統(tǒng)均能發(fā)揮良好的神經(jīng)保護(hù)作用[3]。利拉魯肽是天然GLP-1 的長(zhǎng)效類似物，它對(duì)多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如神經(jīng)退行性疾病具有神經(jīng)保護(hù)作用[4]，但對(duì)TBI的作用尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)可控的氣體沖擊制備TBI牽張損傷模型，然后給予利拉魯肽處理，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞活力、細(xì)胞毒性和細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)，研究利拉魯肽對(duì)細(xì)胞牽張損傷神經(jīng)保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 SH-SY5Y細(xì)胞株購(gòu)自上海然泰生物科技有限公司；Bcl-2、Bax及Caspase-3多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)cell signaling公司；內(nèi)參抗體β-actin和辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；I型膠原蛋白購(gòu)自Sigma公司；BioFlex細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于世聯(lián)博研科技有限公司；細(xì)胞損傷控制器Ⅱ(CIC-Ⅱ)購(gòu)于弗吉尼亞大學(xué)；利拉魯肽購(gòu)自吉爾生化(上海)有限公司；細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 SH-SY5Y細(xì)胞系的培養(yǎng) 將SH-SY5Y貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞株常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2孵育箱中，培養(yǎng)基為DMEM/F12(1∶1)完全培養(yǎng)基，內(nèi)含10%胎牛血清、100 u/mL青霉素和100 u/mL硫酸鏈霉素。細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時(shí)，傳代或用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞活力 MTT法觀察利拉魯肽對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞活力的影響。將培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞胰酶消化后以2×104/mL密度接種于96孔板，培養(yǎng)48 h后，無(wú)血清誘導(dǎo)細(xì)胞分化12 h后，對(duì)照組給予等量的利拉魯肽藥物溶劑；利拉魯肽組給予1 μM利拉魯肽預(yù)處理24 h。每孔加入MTT溶液100 μL，37 ℃孵育4 h后每孔加入三聯(lián)溶解液。溫箱孵育12 h，用酶標(biāo)儀檢測(cè)560 nm波長(zhǎng)處各孔吸光度值(OD值)。

1.4 LDH法檢測(cè)細(xì)胞毒性 取第2代培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞，胰酶消化后以3×105/mL接種于Bioflex細(xì)胞培養(yǎng)板(I型膠原包被)中，培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，實(shí)驗(yàn)分為3組，對(duì)照組、細(xì)胞損傷組以及利拉魯肽治療組。對(duì)照組給予等量的利拉魯肽藥物溶劑；細(xì)胞損傷組將Bioflex細(xì)胞培養(yǎng)板與CIC-Ⅱ細(xì)胞損傷控制器相連接，控制器將氣體脈沖傳送至與密閉的系統(tǒng)緊密連接的BioFlex細(xì)胞培養(yǎng)板。裝置上的閥門和計(jì)時(shí)器可精確控制閥門開(kāi)放和氣體脈沖時(shí)間。通過(guò)調(diào)節(jié)裝置的壓力調(diào)節(jié)器可調(diào)節(jié)控制閥門的氣體脈沖壓力大小。當(dāng)氣體觸發(fā)后會(huì)引起培養(yǎng)板上的硅膠膜快速變形和回彈，從而造成粘附于硅膠膜上的SH-SY5Y細(xì)胞損傷，該實(shí)驗(yàn)設(shè)定計(jì)量閥門壓力為18 PSI(磅每平方英寸)，此時(shí)氣體脈沖壓力1.8～2.0 PSI，制備輕度損傷細(xì)胞模型；利拉魯肽治療組是將輕度損傷的細(xì)胞加入1 μM利拉魯肽處理24 h。分別取對(duì)照組，損傷組和利拉魯肽治療組培養(yǎng)上清液100 μL，嚴(yán)格按照LDH檢測(cè)試劑盒說(shuō)明進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，采用酶標(biāo)儀440 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度。

1.5 蛋白免疫印跡檢測(cè)利拉魯肽對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用 取第2代培養(yǎng)的SH-SY5Y細(xì)胞，胰酶消化后以3×105/mL接種于Bioflex細(xì)胞培養(yǎng)板(I型膠原包被)培養(yǎng)48 h，待細(xì)胞匯合度達(dá)80%時(shí)，實(shí)驗(yàn)分為3組，對(duì)照組、細(xì)胞損傷組以及利拉魯肽治療組。24 h后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SH-SY5Y細(xì)胞，加入RIPA 裂解液，離心收集上清，BCA法測(cè)蛋白濃度，加入上樣緩沖液(Loading buffer)后變性。于10%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，每組上樣量為18 μg，將蛋白轉(zhuǎn)印于硝酸纖維素膜上，2%脫脂奶粉封閉60 min，Bax(1∶800稀釋)、Bcl-2(1∶1000稀釋)和Caspase-3(1∶600稀釋)于4 ℃孵育過(guò)夜。次日，HRP標(biāo)記的二抗室溫?fù)u床孵育 2 h，滴加 ECL 發(fā)光液在凝膠成像系統(tǒng)中顯影。以β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 利拉魯肽能促進(jìn)SH-SY5Y細(xì)胞增殖 為了摸索利拉魯肽適宜的保護(hù)性作用濃度，本研究采用改良型MTT法檢測(cè)并分析細(xì)胞的生長(zhǎng)和存活情況。本實(shí)驗(yàn)分別給予SH-SY5Y細(xì)胞不同濃度利拉魯肽處理(0.1 μM、1 μM和10 μM)。檢測(cè)結(jié)果顯示，利拉魯肽組比對(duì)照組細(xì)胞活力顯著提升，適宜保護(hù)性濃度為1 μM(F=5.931，P<0.05)(見(jiàn)表1)。

表1 不同濃度的利拉魯肽對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞存活率

注：與對(duì)照組比較，aP<0.05

2.2 利拉魯肽能夠減輕細(xì)胞損傷引起的LDH的釋放水平 采用LDH試劑盒檢測(cè)不同處理組中LDH漏出率，進(jìn)而了解各處理組的細(xì)胞毒性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，細(xì)胞損傷組LDH釋放水平明顯提升，而利拉魯肽治療組LDH釋放水平降低(F=10.41，P<0.05)，提示利拉魯肽減輕了機(jī)械牽張誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷(見(jiàn)表2)。

表2 不同處理組LDH釋放水平

注：與細(xì)胞損傷組比較，aP<0.05

2.3 利拉魯肽可以減輕細(xì)胞損傷誘導(dǎo)的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡

2.3.1 利拉魯肽可減少促調(diào)亡蛋白Bax的表達(dá)并増加凋亡抑制蛋白Bcl-2的表達(dá) Bax是Bcl-2家族中研究最廣泛的促調(diào)亡蛋白，當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bcl-2較多時(shí)，調(diào)亡趨勢(shì)減弱；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)Bax增多時(shí)，則Bax形成的同源二聚體占主導(dǎo)則易發(fā)生凋亡。Bcl-2/Bax比值對(duì)決定細(xì)胞是否進(jìn)入調(diào)亡狀態(tài)有重要意義。本實(shí)驗(yàn)采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)各處理組Bax以及Bcl-2的表達(dá)。結(jié)果顯示細(xì)胞牽張損傷組Bax蛋白的表達(dá)較對(duì)照組明顯增多，Bcl-2蛋白表達(dá)減少；利拉魯肽處理組Bax蛋白表達(dá)較牽張損傷組明顯降低(F=10.49，P<0.05)，而Bcl-2蛋白表達(dá)明顯增高(F=19.58，P<0.01)(見(jiàn)圖1，表3)。

圖1 三組的Bax、Bcl-2和β-actin蛋白的表達(dá)

組別BaxBcl?2Caspase?3(OD)對(duì)照組0．25±0．080．43±0．060．67±0．08細(xì)胞損傷組0．52±0．090．17±0．031．21±0．63利拉魯肽組0．24±0．09a0．31±0．06b0．97±0．09a

注：利拉魯肽組與細(xì)胞損傷組比較，aP<0.05，bP<0.01

2.3.2 利拉魯肽可減少Caspase-3的表達(dá) Caspase家族在細(xì)胞調(diào)亡過(guò)程中起非常重要的作用，其中Caspase-3為關(guān)鍵執(zhí)行分子。為檢測(cè)利拉魯肽在細(xì)胞牽張損傷中的抗調(diào)亡作用，采用蛋白免疫印跡檢測(cè)各組中Caspase-3的表達(dá)(見(jiàn)圖2)。如圖所示細(xì)胞牽張損傷組Caspase-3表達(dá)明顯增多，而利拉魯肽組Caspase-3的表達(dá)顯著降低(F=10.05，P<0.05)。

圖2 三組的Caspase-3和β-actin蛋白的表達(dá)

3 討論

TBI是臨床上常見(jiàn)的高致殘性損傷，因TBI給家庭和社會(huì)每年都造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。為更好研究TBI的發(fā)病機(jī)制及藥物干預(yù)治療，相繼出現(xiàn)了許多TBI體外模型(如壓迫損傷模型、氣壓損傷模型)，然而這些模型均無(wú)法準(zhǔn)確、真實(shí)的模擬臨床機(jī)械損傷作用力，無(wú)法滿足實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的需求。細(xì)胞牽張損傷模型可以更加準(zhǔn)確的模擬TBI的致傷作用力[6]，減少影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的混淆因素，簡(jiǎn)單可行。本實(shí)驗(yàn)我們利用細(xì)胞損傷裝置-Ⅱ建立了SH-SY5Y細(xì)胞培養(yǎng)牽張損傷模型。此模型可以同時(shí)對(duì)細(xì)胞造成相對(duì)一致的損傷。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞損傷模型，更接近于人體顱腦損傷的狀態(tài)，可在細(xì)胞和分子水平為我們提供損傷病理過(guò)程中的一系列重要信息，對(duì)了解TBI的病理生理機(jī)制具有重要作用。

雖然對(duì)于TBI的神經(jīng)保護(hù)方面的研究已取得巨大進(jìn)展，但目前臨床上仍缺乏一種切實(shí)有效的藥物。這可能與TBI復(fù)雜的病理生理機(jī)制有關(guān)，這也成為影響患者治療與預(yù)后的主要難題。因此，尋找一種對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)具有保護(hù)作用，達(dá)到治療或延緩疾病進(jìn)展的藥物尤為重要。

2型糖尿病已經(jīng)被認(rèn)為是神經(jīng)退行性性疾病的危險(xiǎn)因素。大腦中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)胰島素信號(hào)受損及胰島素受體脫敏現(xiàn)象?；趦烧呔哂泄餐l(fā)病機(jī)制，已有部分糖尿病治療藥物用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)方面的研究。GLP-1是一種促胰島素激素肽，被用于治療2型糖尿病[7-8]。近年來(lái)研究顯示，除胰腺外，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)存在大量的GLP-1受體。其受體分布的廣泛性決定了其生物學(xué)作用的多樣性。GLP-1受體激動(dòng)劑對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)的保護(hù)及治療作用已被越來(lái)越多的研究所證實(shí)。Kimura等研究顯示GLP-1受體激動(dòng)劑可以刺激神經(jīng)生長(zhǎng)因子的PC12細(xì)胞神經(jīng)突的生長(zhǎng)、增強(qiáng)神經(jīng)細(xì)胞的分化并改善細(xì)胞生存率[9]；GLP-1類似物的艾塞那肽在大鼠短暫大腦中動(dòng)脈閉塞模型中顯示出良好神經(jīng)保護(hù)作用[10]。有研究成果表明，GLP-1可以保護(hù)神經(jīng)元突觸可塑性[11]。另外，因GLP-1 受體激動(dòng)劑能通過(guò)血-腦脊液屏障直接與其受體結(jié)合，發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用被應(yīng)用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病如阿爾茨海默病[12]、帕金森病[13]等神經(jīng)退行性疾病。

利拉魯肽是天然GLP-1的長(zhǎng)效類似物，藥理活性與GLP-1相似，主要用于治療2型糖尿病[14]。利拉魯肽與GLP-1有97%的同源性，既具有相似的生理作用，又不易被降解。由于利拉魯肽的特異性受體在大腦中廣泛分布，近年來(lái)，利拉魯肽的神經(jīng)保護(hù)作用被越來(lái)越多的學(xué)者重視[15]。2014年，GLP-1類似物利拉魯肽首次被用于神經(jīng)退行性疾病的相關(guān)臨床試驗(yàn)研究。它作為一種人源性的GLP-1受體激動(dòng)劑，較天然的GLP-1更穩(wěn)定，可以通過(guò)血腦屏障，可促進(jìn)神經(jīng)元增殖，對(duì)阿爾茨海默病具有神經(jīng)保護(hù)作用[16]。還有研究表明利拉魯肽通過(guò)靶定自噬在β細(xì)胞凋亡中起重要作用[17]。因此，我們認(rèn)為利拉魯肽在細(xì)胞損傷中的保護(hù)作用與抑制細(xì)胞凋亡有密切的關(guān)系。

TBI導(dǎo)致的氧化應(yīng)激、炎性反應(yīng)可引起多種促凋亡因子的釋放，激活下游凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[18]。目前大體上講，凋亡的通路分為Caspases依賴型和Caspases非依賴型兩種。本研究通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞牽張損傷后，細(xì)胞凋亡明顯增加，Caspase-3 表達(dá)也增高，而利拉魯肽處理后，Caspase-3表達(dá)明顯降低。

Caspases依賴型和Caspases非依賴型凋亡均由B細(xì)胞淋巴瘤-2家族蛋白(Bcl-2)調(diào)控。Bcl-2基因家族在細(xì)胞凋亡的發(fā)生中構(gòu)成一個(gè)相互作用、相互制約的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)?？沟蛲龅鞍譈cl-2和促凋亡蛋白Bax的平衡在凋亡發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用[19]。Bcl-2具有抑制細(xì)胞凋亡的作用，且基因表達(dá)量與細(xì)胞凋亡程度成正比，而Bax則作為Bcl-2 家族中最重要的促凋亡基因。因此，Bcl-2過(guò)量表達(dá)可降低細(xì)胞凋亡，Bax過(guò)量表達(dá)則可增強(qiáng)細(xì)胞凋亡。所以，藥物可通過(guò)干預(yù)Bcl-2和Bax的表達(dá)達(dá)到抑制或者促進(jìn)細(xì)胞凋亡的目的。本研究以細(xì)胞損傷控制器牽張損傷SH-SY5Y細(xì)胞來(lái)模擬顱腦創(chuàng)傷的體外模型，探討利拉魯肽是否對(duì)TBI細(xì)胞模型具有神經(jīng)保護(hù)作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利拉魯肽處理組，Bcl-2表達(dá)明顯增高，而Bax表達(dá)下調(diào)，提示利拉魯肽可以抑制細(xì)胞牽張損傷后細(xì)胞凋亡。

LDH是存在于機(jī)體各組織細(xì)胞內(nèi)的一種糖酵解酶。當(dāng)細(xì)胞凋亡或壞死后，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的LDH釋放出來(lái)。因此測(cè)定LDH釋放率可以反映細(xì)胞損傷的情況。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞牽張損傷后SH-SY5Y 細(xì)胞LDH大量釋放，而利拉魯肽處理后，細(xì)胞LDH 的釋放率明顯降低。

綜上所述，利拉魯肽具有抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡的作用，其可能機(jī)制還需進(jìn)一步探索。本研究肯定了利拉魯肽對(duì)TBI細(xì)胞牽張損傷模型的神經(jīng)保護(hù)作用并為其向臨床轉(zhuǎn)化奠定了基礎(chǔ)，并提示利拉魯肽干預(yù)可能成為未來(lái)治療TBI的新方法。

[1] KUMARIA A,TOLIAS CM.In vitro models of neurotrauma[J].Br J Neurosurg,2008,22(2):200-206.

[2] GROENEVELD ON,KAPPELLE LJ,BIESSELS GJ.Potentials of incretin-based therapies in dementia and stroke in type 2 diabetes mellitus[J].J Diabetes Investig,2016,7(1):5-16.

[3] CALSOLARO V,EDISON P.Novel GLP-1 (Glucagon-Like Peptide-1) analogues and insulin in the treatment for alzheimer's disease and other neurodegenerative diseases[J].CNS Drugs,2015,29(12):1023-1039.

[4] CANDEIAS EM,SEBASTIO IC,CARDOSO SM,et al.Gut-brain connection:the neuroprotective effects of the anti-diabetic drug liraglutide[J].World J Diabetes,2015,6(6):807-827.

[5] XIONG Y,ZHANG Y,MAHMOOD A,et al.Investigational agents for treatment of traumatic brain injury[J].Expert OpinInvestig Drugs,2015,24(6):743-760.

[6] SKOTAK M,WANG F,CHANDRA N.An in vitro injury model for SH-SY5Y neuroblastoma cells:effect of strain and strain rate[J].J Neurosci Methods,2012,205(1):159-168.

[7] KUBO F,MIYATSUKA T,SASAKI S,et al.Sustained expression of GLP-1 receptor differentially modulates β-cell functions in diabetic and nondiabetic mice[J].BiochemBiophys Res Commun,2016,471(1):68-74.

[8] 易建,魏娟,廖雨飛,等.胰高血糖素樣肽-1類似物對(duì)2型糖尿病患者血脂的影響[J].實(shí)用藥物與臨床,2015,18 (5):556-558.

[9] KIMURA R,OKOUCHI M,KATO T,et al.Epidermal growth factor receptor transactivation is necessary for glucagon-like peptide-1 to protect PC12 cells from apoptosis[J].Neuroendocrinology,2013,97(4):300-308.

[10] LEE CH,YAN B,YOO KY,et al.Ischemia-induced changes in glucagon-like peptide-1 receptor and neuroprotective effect of its agonist,exendin-4,in experimental transient cerebral ischemia[J].J Neurosci Res,2011,89(7):1103-1113.

[11] OKA JI,GOTO N,KAMEYAMA T.Glucagon-like peptide-1 modulates neuronal activity in the rat's hippocampus[J].Neuroreport,1999,10(8):1643-1646.

[12] 李玉峰，張生校，祁金順.抗糖尿病藥物GLP-1在阿爾茨海默病中的神經(jīng)保護(hù)作用及其分子機(jī)制研究進(jìn)展[J].生理科學(xué)進(jìn)展,2016,47(1):47-52.

[13] HANSEN HH,FABRICIUS K,BARKHOLT P,et al.Characterization of liraglutide,a glucagon-like peptide-1 (GLP-1) receptor agonist,in rat partial and full nigral 6-hydroxydopamine lesion models of Parkinson's disease[J].Brain Res,2016,1646:354-465.

[14] 丁卓玲,熊杏安,肖碩.利拉魯肽在2型糖尿病治療中的應(yīng)用進(jìn)展[J].實(shí)用藥物與臨床,2014,17 (5):615-618.

[15] LI Y,LI L,H?LSCHER C.Incretin-based therapy for type 2 diabetes mellitus is promising for treating neurodegenerative diseases[J].Rev Neurosci,2016,27(7):689-711.

[16] MCCLEAN PL,JALEWA J,H?LSCHER C.Prophylactic liraglutide treatment prevents amyloid plaque deposition,chronic inflammation and memory impairment in APP/PS1 mice[J].Behav Brain Res,2015,293(1):96-106.

[17] CHEN ZF,LI YB,HAN JY,et al.Liraglutide prevents high glucose level induced insulinoma cells apoptosis by targeting autophagy[J].Chin Med J (Engl),2013,126(5):937-941.

[18] SCHOCH KM,MADATHIL SK,SAATMAN KE.Genetic manipulation of cell death and neuroplasticity pathways in traumatic brain injury[J].Neurotherapeutics,2012,9(2):323-337.

[19] BESBES S,MIRSHAHI M,POCARD M,et al.New dimension in therapeutic targeting of BCL-2 family proteins[J].Oncotarget,2015,6(15):12862-12871.