細(xì)鱗鮭魚源病原菌的分離、鑒定及藥敏實(shí)驗(yàn)

文/魏凱 楊華蓮 韓姝伊 陳春山

細(xì)鱗鮭是國(guó)產(chǎn)名貴的冷水性魚類，也是列入農(nóng)業(yè)農(nóng)村部珍稀水生動(dòng)物增殖放流計(jì)劃的魚類，主養(yǎng)區(qū)在東北和華北地區(qū)。由于苗種成活率低，因此各養(yǎng)殖場(chǎng)的養(yǎng)殖規(guī)模都不是很大。主要原因有兩個(gè)：一是稚魚對(duì)人工餌料的不適應(yīng)性，二是早期發(fā)生不明原因死亡。2017年7月，北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心實(shí)驗(yàn)養(yǎng)殖的細(xì)鱗鮭魚苗突發(fā)大規(guī)模死亡，典型癥狀為：眼球凸出，鰓蓋邊緣、鰭條基部充血，部分病魚肛門紅腫。為了控制該疾病的蔓延，對(duì)從自然發(fā)病的細(xì)鱗鮭肝臟、腎臟、腸道處分離得到的菌株進(jìn)行了理化特性及耐藥性分析。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可為細(xì)鱗鮭細(xì)菌性疾病的診斷、防治和用藥提供參考。

一、材料與方法

（一）實(shí)驗(yàn)材料

細(xì)鱗鮭采集于北京市水生野生動(dòng)植物救護(hù)中心?；疾◆~體長(zhǎng)3.2cm～4.0cm，體重為0.18g～0.31g，典型癥狀為：眼球凸出，鰓蓋邊緣、鰭條基部充血，部分病魚肛門紅腫。健康魚體長(zhǎng)5cm～8cm，體重6g～8g，在實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)21d確定健康后用于回歸感染實(shí)驗(yàn)。

（二）細(xì)菌的分離純化

取病癥明顯的細(xì)鱗鮭，在無(wú)菌條件下采集肝臟、腎臟、腸道，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，28℃倒置培養(yǎng)24h。挑取形態(tài)一致的單個(gè)優(yōu)勢(shì)菌落進(jìn)行革蘭氏染色，并進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，得到3株優(yōu)勢(shì)菌分別命名為BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3。

（三）細(xì)菌的生理生化鑒定

取純化后的BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3菌株接種于細(xì)菌生化鑒定管中，進(jìn)行葡萄糖、吲哚等項(xiàng)目的生理生化特性測(cè)定，生化試驗(yàn)結(jié)果參照伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)方法進(jìn)行判定。

（四）藥敏實(shí)驗(yàn)

藥敏實(shí)驗(yàn)采用紙片擴(kuò)散法進(jìn)行。使用比濁儀調(diào)節(jié)BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3菌液濃度為0.5個(gè)麥?zhǔn)蠞岫龋詿o(wú)菌棉拭子蘸取菌液均勻涂布培養(yǎng)基表面，再用鑷子將藥敏紙片貼于MH瓊脂平板表面。28℃培養(yǎng)24h后測(cè)量不同藥物的抑菌圈直徑(mm)，并根據(jù)CLSI標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥敏結(jié)果判定。

（五）16SrDNA序列測(cè)定

利用細(xì)菌16SrDNA通用引物對(duì)BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3株16SrDNA基因進(jìn)行擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后，陽(yáng)性樣品由北京六合華大科技有限公司測(cè)序。將陽(yáng)性PCR產(chǎn)物的測(cè)定結(jié)果提交到GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行BLAST比對(duì)。

（六）回接感染實(shí)驗(yàn)

使用菌液濃度為1.0×108CFU/mL、1.0×107CFU/mL、1.0×106CFU/mL、1.0×105CFU/mL、1.0×104CFU/mL的細(xì)菌懸液進(jìn)行回接感染實(shí)驗(yàn)。各試驗(yàn)組用健康細(xì)鱗魚10尾。采用腹腔注射的方式進(jìn)行攻毒，注射劑量為0.05mL/尾。同時(shí)設(shè)注射無(wú)菌生理鹽水的對(duì)照組。分別于24h、48h及72h后觀察記錄死亡情況，同時(shí)計(jì)算菌株半數(shù)致死量(LD50)。取具有發(fā)病癥狀的細(xì)鱗鮭，無(wú)菌條件下進(jìn)行細(xì)菌的再分離培養(yǎng)，并比較分離到的細(xì)菌和攻毒所用菌株的理化特征，鑒定病原菌。

二、結(jié)果與分析

（一）細(xì)菌形態(tài)特征

BJSY-1、BISY-2、BJSY-3都為革蘭氏陰性菌，呈短桿狀，在普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上形成濕潤(rùn)微凸、圓形光滑、邊緣整齊、灰白色、大小不一的菌落。

（二）生理生化鑒定結(jié)果

菌株BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3的生化鑒定結(jié)果如表1所示。其中BJSY-1菌株氧化酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，不具有運(yùn)動(dòng)性，不利用枸椽酸鹽，不形成吲哚，V.P.試驗(yàn)呈陰性，能發(fā)酵葡萄糖，不能發(fā)酵蔗糖、棉子糖、山梨醇、蜜二糖；BJSY-2菌株具有運(yùn)動(dòng)性，能發(fā)酵葡萄糖，不發(fā)酵纖維二糖、麥芽糖、鼠李糖、乳糖、木糖，與精氨酸雙水解酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，與賴氨酸脫羧酶、鳥氨酸脫酸酶反應(yīng)呈陰性；BJSY-3菌株具有運(yùn)動(dòng)性，與鳥氨酸脫羧酶、氧化酶反應(yīng)呈陽(yáng)性，不能發(fā)酵蔗糖、鼠李糖、麥芽糖等。參照《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊(cè)》，初步判定BJSY-1為殺鮭氣單胞菌，BJSY-2為惡臭假單胞菌，BJSY-3為腐敗希瓦氏菌。

（三）藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果

分離株BJSY-1的藥物敏感性如表2所示，對(duì)卡那霉素、左氧氟沙星、頭孢呋辛鈉、四環(huán)素、氯霉素、甲氧芐啶、喹諾類藥物高度敏感。分離株BJSY-2對(duì)卡那霉素、磺胺甲噁唑、左氧氟沙星、頭孢呋辛鈉、四環(huán)素、氨芐西林及喹諾酮類藥物高度敏感，如表3所示。分離株BJSY-3的藥物敏感性與前兩株相近，對(duì)四環(huán)素類、喹諾酮類藥物高度敏感，對(duì)青霉素、萬(wàn)古霉素等具有耐藥性（見表4）。

表1 分離株BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3的生理生化特性

表2 分離株BJSY-1的藥物敏感性

表3 分離株BJSY-2的藥物敏感性

表4 分離株BJSY-3的藥物敏感性

（四）16SrDNA測(cè)序

分離株BJSY-1、BJSY-2、BJSY-3用于16SrDNAPCR擴(kuò)增和測(cè)序。PCR反應(yīng)獲得1500bp左右長(zhǎng)度的特異性目的片段，測(cè)序后分別獲得1430bp、1680bp、1700bp的準(zhǔn)確序列，經(jīng)同源性檢索后顯示，BJSY-1序列與氣單胞菌屬的殺鮭氣單胞菌殺鮭亞種核苷酸同源性達(dá)到99%以上。BJSY-2序列與惡臭假單胞菌ATCC1117216S的核苷酸同源性達(dá)99%以上，該序列在GenBank的登錄號(hào)為AF094745.1。BJSY-3序列則與腐敗希瓦氏菌同源性達(dá)到99%以上，該序列在GenBank的登錄號(hào)為MG576030.1。

（五）回接感染實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3株分離菌均對(duì)細(xì)鱗鮭有不同程度的致病性，其中BJSY-1的致病性最強(qiáng)。接種1.0×108CFU/mLBJSY-1菌液的細(xì)鱗鮭14天內(nèi)的死亡率為100%，接種1.0×108CFU/mLBJSY-2、BJSY-3后14天后的死亡率分別為40%和20%。而且人工感染BJSY-1后的發(fā)病細(xì)鱗鮭均表現(xiàn)出鰭條基部及尾柄處充血、鰭潰爛，眼球凸出，肛門紅腫的癥狀，與自然發(fā)病細(xì)鱗鮭一致，如圖1、2所示。由此證明BJSY-1為此次細(xì)鱗鮭發(fā)病的主要致病菌，BJSY-2和BJSY-3為輔助致病菌。利用Reed和Muench氏法計(jì)算BJSY-1菌株的半數(shù)致死量LD50為6.97x105CFU/mL。

（六）藥物療效

根據(jù)藥敏實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取了三個(gè)菌株都高度敏感的四環(huán)素類藥物鹽酸多西環(huán)素拌餌投喂治療。每1kg餌料加4g～6g鹽酸多西環(huán)素，每天投喂兩次，同時(shí)給發(fā)病魚池潑灑鹽酸多西環(huán)素進(jìn)行殺菌，有效地控制了疾病的傳播。

圖1 鰭條基部充血、肛門紅腫的死亡細(xì)鱗鮭

圖2 肝臟上有出血點(diǎn)的死亡細(xì)鱗鮭

圖3 眼球突出充血

三、討論

殺鮭氣單胞菌在世界上分布的地區(qū)廣泛，能引起人類和多種動(dòng)物的疾病，是鮭科魚類癤瘡病的病原體。癤瘡病發(fā)病率高，死亡率高，影響著世界范圍內(nèi)的水產(chǎn)養(yǎng)殖。殺鮭氣單胞菌可分為五個(gè)亞種：殺鮭亞種、無(wú)色亞種、溶果膠亞種、史式亞種和殺日本鮭亞種。其中殺鮭亞種為典型株，可引起鮭科魚類眼球突出，鰓絲紅腫，魚鰭基部出血，嚴(yán)重者在體表形成膿腫或潰瘍。殺鮭氣單胞菌是一種條件致病菌，在魚類受到環(huán)境脅迫時(shí)容易發(fā)病。

惡臭假單胞菌是魚類腸道菌群的重要成員之一，也為條件致病菌，當(dāng)環(huán)境條件適宜其生長(zhǎng)繁殖且魚體抵抗力較弱時(shí)容易受到病原的侵襲。腐敗希瓦氏菌是一種導(dǎo)致人畜共患病的病原菌，也能夠引起水產(chǎn)動(dòng)物發(fā)病。國(guó)外目前僅發(fā)現(xiàn)鯉魚和虹鱒感染腐敗希瓦氏菌的病例。本實(shí)驗(yàn)分離到的腐敗希瓦氏菌對(duì)細(xì)鱗鮭的致病性不強(qiáng)，可能是因?yàn)榉蛛x到的菌株毒性較弱，這表明受到環(huán)境脅迫時(shí)的魚類免疫力下降，很容易遭受到毒性較弱的病原菌的入侵從而導(dǎo)致感染的發(fā)生。據(jù)此分析，本次疾病的爆發(fā)主要是由于此階段的細(xì)鱗鮭魚苗正處在開口攝食人工飼料不久的階段，體質(zhì)較弱，抵抗力差，從而引發(fā)了殺鮭氣單胞菌同惡臭假單胞菌和腐敗希瓦氏菌的共同感染。

細(xì)鱗鮭是近幾年推廣養(yǎng)殖的國(guó)產(chǎn)鮭科魚類，各地養(yǎng)殖的細(xì)鱗鮭幼苗期均出現(xiàn)不明原因死亡現(xiàn)象，癥狀與本實(shí)驗(yàn)發(fā)病魚癥狀相同。本實(shí)驗(yàn)選取鹽酸多西環(huán)素進(jìn)行治療，取得了較好的治療效果。鹽酸多西環(huán)素屬于四環(huán)素類抗生素，為一種廣譜抑菌劑，通過(guò)破壞致病菌細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β酰氨，4糖苷類鍵，使其細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，致病菌因細(xì)胞壁破裂內(nèi)容物逸出而被溶解（殺死），達(dá)到消炎、修復(fù)組織的目的，但不可以長(zhǎng)期大劑量使用。一方面，容易誘發(fā)魚類對(duì)細(xì)菌和真菌的二重感染；另一方面，防止細(xì)菌對(duì)鹽酸多西環(huán)素產(chǎn)生耐藥性，避免耐藥菌株的出現(xiàn)。

本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究殺鮭氣單胞菌、惡臭假單胞菌和腐敗希瓦氏菌的致病性及耐藥性提供了理論依據(jù)。在細(xì)鱗鮭細(xì)菌性疾病防治過(guò)程中，科學(xué)地和針對(duì)性地用藥，避免盲目用藥導(dǎo)致病原菌耐藥性的增強(qiáng)，同時(shí)也應(yīng)積極研發(fā)疫苗，逐漸減少抗生素類藥物的使用，維持生態(tài)環(huán)境的平衡。

休閑漁業(yè)已成為我國(guó)漁業(yè)的五大產(chǎn)業(yè)之一，與水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)、捕撈業(yè)、加工業(yè)、增殖業(yè)并重。為推動(dòng)休閑漁業(yè)發(fā)展，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部于2016年召開了休閑漁業(yè)現(xiàn)場(chǎng)會(huì)，2017年開始把休閑漁業(yè)發(fā)展納入監(jiān)測(cè)，加強(qiáng)對(duì)休閑漁業(yè)的管理和服務(wù)，接下來(lái)還將實(shí)施一系列舉措推動(dòng)我國(guó)休閑漁業(yè)發(fā)展。配合國(guó)家相關(guān)方針政策和產(chǎn)業(yè)發(fā)展需要，本刊特開辟“休閑漁悅”欄目，歡迎廣大讀者就相關(guān)內(nèi)容投稿。