烏藥提取物對(duì)酒精性肝損傷大鼠門靜脈內(nèi)毒素及小腸組織形態(tài)學(xué)的干預(yù)研究

季夢漂 樓招歡 譚明明 丁慧珍 胡志希 王軍偉

酒精性肝損傷（alcoholic liver disease，ALD）是常見的肝臟早期損傷形式之一。目前，短期內(nèi)過量飲酒的現(xiàn)象與酗酒成癮造成的慢性酒精攝入均呈上升趨勢，若不及早防治，約8%～20%可發(fā)展為肝硬化。關(guān)于酒精誘導(dǎo)肝損傷的輔助因素及介導(dǎo)途徑的連鎖反應(yīng)研究是ALD的熱點(diǎn)，其中包括腸道內(nèi)毒素和腸滲漏[1]。本課題組前期研究表明，烏藥可通過減輕炎癥反應(yīng)[2]、抑制抗氧化損傷[3]等作用直接保護(hù)肝組織。因此，本研究以“腸－肝軸”為切入點(diǎn)，進(jìn)一步探討烏藥不同提取物對(duì)ALD大鼠腸道內(nèi)毒素及組織形態(tài)學(xué)的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 健康SD大鼠88只，雄性，體重180～220g，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：0016074。烏藥：由浙江省天臺(tái)山烏藥生物工程有限公司提供，2013年8月采自浙江省天臺(tái)縣三州鄉(xiāng)，經(jīng)該公司陳方標(biāo)藥師鑒定為樟科山胡椒屬植物烏藥Lindera aggregata（Sims）Kosterm的干燥塊根。陽性對(duì)照組采用思密達(dá)[博福－益普生（天津）制藥有限公司]，規(guī)格3g×10袋，用蒸餾水配制成濃度為0.09g/ml的混懸液備用。白酒：紅星二鍋頭酒（酒精濃度52%），2.0L/瓶，北京紅星股份有限公司；與雙蒸水按一定體積比例稀釋，乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%。儀器：TBA－40FR全自動(dòng)生化儀（日本東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社）；Powerwave340酶標(biāo)儀（美國Bio－TEK公司）；LEICA RM2245切片機(jī)（德國LEICA公司）；VIP－5－Jr－J2組織全自動(dòng)脫水機(jī)（日本 Sakura公司）；EC360組織自動(dòng)包埋機(jī)（南京美康科技有限公司）；YR－21全自動(dòng)染色機(jī)（湖北亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；BA410生物顯微鏡、Adavance3.2圖象分析系統(tǒng)（香港Motic公司）；Hitachi－7650透射電鏡（日本Hitachi公司）。

1.2 烏藥提取物的制備 水提取物制備：取烏藥500g，加入12倍量水100℃回流提取1.5h，濾取藥液，藥渣繼用10倍量水以相同條件提取1h，濾取藥液，合并兩次藥液，減壓回收并適當(dāng)濃縮，即得烏藥水提取物（WYSTW）。醇提取物制備：取烏藥500g，加入12倍量75%乙醇100℃回流提取1.5h，濾取藥液，藥渣繼用10倍量75%乙醇以相同條件提取1h，濾取藥液，合并2次藥液，減壓回收乙醇并適當(dāng)濃縮，即得烏藥醇提取物（WYCTW）。醇提取物各萃取物：取WYCTW適量依次用石油醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇分次萃取至色淡，分取并合并各萃取層，減壓回收溶劑，分別得烏藥醇提取物石油醚萃取物（WYCTC1）、烏藥醇提取物乙酸乙酯萃取物（WYCTC2）、烏藥醇提取物正丁醇萃取物（WYCTC3）。取WYCTW各萃取物，用適量吐溫80研磨后，加水置磁力攪拌器混勻，加蒸餾水稀釋，使每毫升藥液相當(dāng)于1g生藥，即得各萃取物溶液。上述各溶液，臨用前用適量蒸餾水稀釋，使每毫升藥液相當(dāng)于0.4g生藥。

1.3 動(dòng)物分組與造模 選取健康雄性SD大鼠88只隨機(jī)分為8組，每組11只，即正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、陽性對(duì)照組（思密達(dá) 0.9g/kg）、WYSTW（4g/kg）組、WYCTW（4g/kg）組 、WYCTC1（4g/kg）組 、WYCTC2（4g/kg）組 、WYCTC3（4g/kg）組，所有大鼠均給予基礎(chǔ)飼料，自由采食飲水。除正常對(duì)照組（以等體積的蒸餾水灌胃）外，其余各組大鼠均給予乙醇體積分?jǐn)?shù)50%的白酒灌胃造模，1次/d，灌胃容積1.2ml/100g，連續(xù)33d造模結(jié)束。自造模第1天起，除正常對(duì)照組和模型對(duì)照組灌服蒸餾水外，其余各給藥組分別給予相應(yīng)的藥物灌胃，1次/d，灌胃容積為1ml/100g（即相當(dāng)于每100g體重灌入0.4g生藥），連續(xù) 33d。

1.4 觀察指標(biāo) （1）門靜脈血內(nèi)毒素（ET）、TNF－α檢測：所有大鼠末次給藥后禁食12h，一次性灌胃給予10mg/kg脂多糖（LPS，美國Sigma公司），3.5h后處死大鼠分別于肝門靜脈和腹主動(dòng)脈取血，離心制備血清，采用酶聯(lián)免疫法測定血清中ET、TNF－α含量（試劑批號(hào)20140801A，上海源葉生物科技有限公司）。（2）組織病理學(xué)檢查：取回盲部上方15 cm處小腸相同部位，用10% 中性甲醛固定，石蠟包埋，蘇木精－伊紅（HE）染色后于光學(xué)顯微鏡（×100）下觀察腸道組織病理學(xué)改變。（3）腸黏膜電鏡觀察：透射電鏡下觀察末段回腸黏膜上皮通透性。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)；多組間比較采用方差分析，兩兩比較方差齊時(shí)采用LSD－t法，方差不齊時(shí)采用Tamhane’s T2法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 烏藥不同提取物對(duì)ALD模型大鼠門靜脈血ET、TNF－α含量的影響 與正常對(duì)照組相比，模型對(duì)照組大鼠門靜脈血ET、TNF－α含量明顯升高（P＜0.01）。與模型對(duì)照組相比，各給藥組大鼠上述指標(biāo)含量明顯降低（P＜0.05或0.01）。與陽性對(duì)照組相比，WYSTW降低指標(biāo)程度與其相當(dāng)，而WYCTW降低程度更明顯（P＜0.01）。WYCTW的3個(gè)萃取物中，又以WYCTC1和WYCTC3效果較優(yōu)。見表1。

表1 烏藥不同提取物對(duì)ALD模型大鼠門靜脈血ET、TNF-α含量的影響

2.2 對(duì)ALD模型大鼠小腸組織形態(tài)學(xué)的影響 光鏡下可見正常對(duì)照組大鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞形態(tài)及結(jié)構(gòu)基本正常，微絨毛整齊、密集，無缺損；模型對(duì)照組大鼠小腸黏膜呈部分腸上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，間質(zhì)輕度水腫，少量炎細(xì)胞浸潤，絨毛橫徑增寬。與模型對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組及烏藥各給藥組大鼠小腸組織病理變化程度明顯減輕。見圖1（插頁）。

2.3 對(duì)ALD模型大鼠小腸黏膜微結(jié)構(gòu)的影響 透射電鏡下可見正常對(duì)照組大鼠小腸上皮細(xì)胞微絨毛排列整齊、緊密連接，線粒體無明顯損傷（圖2a）；模型對(duì)照組大鼠小腸上皮可見不規(guī)則、稀疏的微絨毛及腫脹、空泡變性的線粒體（圖2b）；與模型對(duì)照組相比，陽性對(duì)照組（圖 2c）與烏藥各給藥組（圖 2d、e、f、g、h）大鼠小腸黏膜呈緊密連接的簇狀微絨毛明顯增多，同時(shí)線粒體形態(tài)較之正常，結(jié)構(gòu)完整。見圖2（插頁）。

3 討論

《諸病源候論》云：“酒者，水谷之精也。其氣焊而有大毒，入于肝膽……?！本茷闈駸岫?，多飲則蘊(yùn)積化毒，戕伐臟腑。長期大量酒精攝入引發(fā)氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化使肝細(xì)胞遭遇初次打擊形成脂肪肝，而腸黏膜受損，由內(nèi)毒素介導(dǎo)的低水平腸源性內(nèi)毒素血癥，又刺激肝臟發(fā)生炎癥、壞死和纖維化形成“二次打擊”[4]。肝臟對(duì)來自體內(nèi)外的非營養(yǎng)性物質(zhì)如藥物、毒物、代謝產(chǎn)物具有生物轉(zhuǎn)化作用，這一生理特性也決定了肝臟是最易受侵害和需自我保護(hù)的組織，因此以往抗氧化、抗炎、降脂、保護(hù)肝細(xì)胞的單一治療模式已不適用。

烏藥為理氣藥，具有行氣止痛，溫腎散寒之效。以往作為經(jīng)典方劑的重要組成，在中醫(yī)歷史上為支氣管哮喘、肺氣腫、胃腸紊亂、痛經(jīng)、疝氣、睪丸炎等眾多患者解除病痛。藥理學(xué)研究也顯示烏藥對(duì)免疫系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng)以及抗病毒等方面均具有廣泛的藥理活性[5]。中藥多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)、多途徑整合調(diào)節(jié)的治療模式有著西藥不可比擬的優(yōu)勢，為全面探究烏藥治療ALD的作用機(jī)制，本研究提取烏藥有效成分進(jìn)行干預(yù)，以期為開發(fā)治療酒精肝的藥物奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

本實(shí)驗(yàn)采用門靜脈血ET、TNF-α含量作為反映肝損傷的重要指標(biāo)。眾所周知，酒精作為肝臟毒劑，可削弱正常肝細(xì)胞的代謝及結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，損傷線粒體功能，同時(shí)又可致小腸黏膜通透性增加，屏障功能減弱，細(xì)菌過度滋生，釋放大量內(nèi)毒素[6]，最終導(dǎo)致腸源性內(nèi)毒素滲漏，加重肝損傷。內(nèi)毒素是腸道革蘭陰性菌細(xì)胞壁裂解后釋放出的脂多糖，其可通過刺激庫普弗細(xì)胞激活誘導(dǎo)TNF-α的產(chǎn)生[7]，本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)大鼠血清TNF-α與門靜脈血ET含量呈正相關(guān)?，F(xiàn)已有大量研究闡明“酒精-內(nèi)毒素-庫普弗細(xì)胞-TNF-α等細(xì)胞因子-肝臟炎癥”這一損傷途徑和機(jī)制[8]。在本實(shí)驗(yàn)中，模型對(duì)照組門靜脈血ET、TNF-α 含量顯著升高（P＜0.01），烏藥各給藥組卻對(duì)上述指標(biāo)變化呈現(xiàn)明顯的抑制效應(yīng)，表明烏藥提取物抗大鼠ALD作用機(jī)制與抑制內(nèi)毒素——TNF-α通路有關(guān)。進(jìn)一步從病理學(xué)角度探究，光鏡下，模型對(duì)照組小腸黏膜呈部分腸上皮細(xì)胞變性、壞死、脫落，間質(zhì)輕度水腫，各給藥組大鼠小腸組織病理變化程度明顯減輕；電鏡下，各給藥組小腸上皮呈緊密連接的簇狀微絨毛較模型組明顯增多，線粒體形態(tài)較之正常，說明烏藥提取物抑制內(nèi)毒素及炎癥因子的作用可能是通過保護(hù)腸黏膜微絨毛，修復(fù)上皮緊密連接結(jié)構(gòu)缺損，改善腸道屏障功能，降低腸道通透性實(shí)現(xiàn)的。

藥效作用對(duì)比，發(fā)現(xiàn)WYCTW在調(diào)節(jié)門靜脈血內(nèi)毒素和炎癥因子上的作用優(yōu)于WYSTW及陽性藥物；醇提取物3個(gè)萃取物中，WYCTC1和WYCTC3效果較優(yōu)。已知烏藥中化學(xué)成分主要有揮發(fā)油、異喹啉生物堿類及呋喃倍半萜三大類[9]。其中，異喹啉生物堿類組分為水溶性，易用水提法得到；呋喃倍半萜組分為脂溶性，醇提部位濃度較高[10]。雖然目前無法得知烏藥作用的具體有效成分及藥效部位，但可大膽推測呋喃倍半萜組分可能是烏藥護(hù)肝的主要成分。

綜上所述，烏藥不同提取物抗大鼠ALD的作用機(jī)制與抑制內(nèi)毒素——TNF-α通路有關(guān)，具體可能是通過改善酒精引起的腸黏膜損傷、減輕腸源性內(nèi)毒素血癥來實(shí)現(xiàn)的。其主要起效成分可能為呋喃倍半萜組分，而科學(xué)提取和使用烏藥護(hù)肝活性成分仍有待更深入的研究。

[1]Chiu WC,Huang YL,Chen YL,et al.Synbiotics reduce ethanolinduced hepatic steatosis and inflammation by improving intestinal permeability and microbiota in rats[J].Food&function,2015,6(5):1692-1700.

[2]王軍偉,胡培陽,陳昕昳,等.烏藥對(duì)急性酒精性肝損傷模型大鼠炎性因子的影響[J].中華災(zāi)害救援醫(yī)學(xué),2014,2(7):373-376.

[3]陳卓亮,王軍偉,譚明明,等.烏藥水提物與醇提物對(duì)急性酒精性肝損傷模型大鼠抗氧化作用的比較研究[J].浙江中醫(yī)雜志,2015,50(6):414-415.

[4]Schaffert CS,Duryee MJ,Hunter CD,et al.Alcoholmetabolites and lipopolysaccharide:rolesin the development and/or progression of alcoholic liver disease[J].World J Gastroenterol,2009,15(10):1209-1218.

[5]陳方亮,余翠琴.烏藥的藥理研究概況[J].海峽藥學(xué),2011,23(12):44-46.

[6]Tang Y,Forsyth CB,Keshavarzian A.The role ofmiRNAs in alcoholinduced endotoxemia,dysfunction of mucosal immunity,and gut leakiness[J].Alcoholism,clinicaland experimentalresearch,2014,38(9):2331-2334.

[7]李曉非,黃山,汪亞玲,等.中西醫(yī)結(jié)合治療肝衰竭對(duì)TNF-α、IL-6及血清內(nèi)毒素水平的影響[J].昆明醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2016,37(4):76-79.

[8]曹健美,崔劍巍,方志紅,等.健脾理氣活血方對(duì)酒精性肝損傷大鼠血漿內(nèi)毒素和TNF-α蛋白表達(dá)的影響[J].上海中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2008,22(5):44-47.

[9]魏國清,蔣合眾,陳惠,等.烏藥化學(xué)成分研究進(jìn)展[J].成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2013,36(3):103-105.

[10]湯小剛,洪汝濤.水提烏藥與醇提烏藥對(duì)急性酒精性肝損傷模型大鼠的保護(hù)作用[J].中國臨床藥理學(xué)雜志,2016,32(8):703-706.