金針菇中棒曲霉素高效液相色譜檢測(cè)法的研究

石寶俊，葛 玲，姜洪芳，林群英，朱海亮，張衛(wèi)明

(1.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 210042；2.億利耐雀生物科技有限公司,江蘇 南京 210038; 3. 南京大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院, 江蘇 南京210093)

金針菇[Flammulinavelutipes(Curt.:Fr.) Sing.]又名冬菇、樸菇、構(gòu)菌、青杠菌、毛柄金錢菌,隸屬擔(dān)子菌亞門(Basidiomycotina),層菌綱(Hymenomycetes),傘菌目(Agaricales),口蘑科(Tricholomataceae),金錢菌屬(Flammulina)[1]。金針菇菌蓋滑嫩、菌柄細(xì)長(zhǎng)脆嫩,形美,味鮮,是世界上著名的食藥兩用菌和觀賞菌[2],具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值,有廣闊的開(kāi)發(fā)前景。 金針菇在物流運(yùn)輸過(guò)程中，極容易受到病原菌的影響，從而感染棒曲霉素的產(chǎn)生菌，產(chǎn)生棒曲霉素，對(duì)人體健康造成危害。棒曲霉素(patulin )又名展青霉素，是由曲霉和青霉等常見(jiàn)食源性真菌所產(chǎn)生的一種次級(jí)代謝產(chǎn)物[3]。棒曲霉素，分子式為C7H6O4，分子量為154，化學(xué)名稱4-羥基-4-氫-呋喃(3，2碳)并吡喃-2(6氫)酮(4-hydroxy-4H-furo[3,2C]pyran-2 (6H)-one)，是一種雜環(huán)內(nèi)酮結(jié)構(gòu)化合物。毒理學(xué)試驗(yàn)表明，棒曲霉素具有致癌、致畸和免疫受損等毒理作用，對(duì)人體有一定危害，可導(dǎo)致呼吸、泌尿、神經(jīng)等系統(tǒng)的損壞甚至衰弱[4]。棒曲霉素廣泛存在于各種霉變的水果蔬菜中，甚至部分有霉變趨勢(shì)的好果中其含量也比較高[5]。因而，西歐各國(guó)對(duì)蘋(píng)果及其制品中的棒曲霉素限量有嚴(yán)格規(guī)定，最高限量為50 μg/kg[6]，而歐盟和日本已經(jīng)將嬰兒食品中的這一標(biāo)準(zhǔn)提高到10 μg/kg。目前水果及其制品中棒曲霉素的檢測(cè)方法日漸成熟，而蔬菜中棒曲霉素的檢測(cè)研究還很少，尤其金針菇中棒曲霉素的檢測(cè)幾乎無(wú)人研究。隨著金針菇在食品藥品領(lǐng)域的運(yùn)用，摸索出一種靈敏度，回收率與重復(fù)性都很高的檢測(cè)方法至關(guān)重要。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和儀器

材料：金針菇(鎮(zhèn)江田潤(rùn)發(fā)生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司)，棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品(≥98%，上海滬崢生物科技有限公司)，乙酸乙酯(AR，南京化學(xué)試劑股份有限公司)，冰醋酸(AR國(guó)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑有限公司，乙腈(HPLC,tedia company)，乙醇(AR，南京化學(xué)試劑有限公司),乙酸鈉(AR，南京化學(xué)試劑有限公司)，無(wú)水碳酸鈉(AR南京化學(xué)試劑有限公司)。

儀器：組織搗碎機(jī)(JJ-2BS，崢嶸儀器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(RE52-AA，上海亞榮生化儀器廠)，高效液相色譜儀(1200，美國(guó)安捷倫公司)，多用循環(huán)水式真空泵(SHZ-DⅢ，鞏義市予華儀器有限公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 青霉菌的培養(yǎng)

PDA培養(yǎng)基的制作：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸0.5 h，紗布過(guò)濾，再加10～20 g葡萄糖和17～20 g瓊脂，充分溶解后趁熱紗布過(guò)濾，分裝試管，每試管約5 mL(試管大小為10 mL)，15磅蒸氣(121 ℃)滅菌20 min左右后取出試管擺斜面，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

PD液體培養(yǎng)基的制作：稱取200 g馬鈴薯，洗凈去皮切碎，加水1 000 mL煮沸0.5 h，紗布過(guò)濾，再加10～20 g葡萄糖，充分溶解后趁熱紗布過(guò)濾， 121 ℃滅菌20 min左右后取出，冷卻后貯存?zhèn)溆谩?/p>

青霉菌的固體培養(yǎng)：在無(wú)菌環(huán)境下，將青霉菌菌種接種在PDA培養(yǎng)基上，待長(zhǎng)出菌落后，從菌落邊緣挑取少量菌絲，接種在PDA培養(yǎng)基的斜面上，28 ℃下培養(yǎng)7天，使菌絲長(zhǎng)滿斜面。

青霉菌的液體培養(yǎng)：在無(wú)菌環(huán)境下，挑取少量上述固體培養(yǎng)基中的青霉菌菌絲，置于含有PDA液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，在28 ℃下，搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min，培養(yǎng)7天，使液體培養(yǎng)基中布滿菌絲。

青霉菌混懸液：取斜面固體培養(yǎng)的青霉菌試管，加入蒸餾水，使用刮條輕輕剝離青霉菌絲，轉(zhuǎn)移至噴瓶?jī)?nèi)，成青霉菌混懸液。

2.2 棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

配制醋酸-醋酸鈉緩沖液：稱取醋酸鈉5.1 g，加入冰醋酸20 mL，用純凈水稀釋定量到200 mL。

配制棒曲霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液：用移液槍吸取少量醋酸-醋酸鈉緩沖液置于棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品樣品瓶中，振蕩，溶解，不易溶解情況下可適當(dāng)超聲，溶解完全后，用移液槍移至5 mL容量瓶中，用緩沖液少量多次潤(rùn)洗標(biāo)準(zhǔn)品樣品瓶，洗液依次移入容量瓶，用緩沖液定容至刻度，成1 mg/mL的棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液[7]。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

2.3.1 液相色譜條件的摸索

(1)色譜條件

色譜柱：ODS反相柱(C18柱)；檢測(cè)器：紫外檢測(cè)器，波長(zhǎng)276 nm；柱溫：30 ℃。

流動(dòng)相使用乙腈和水混合。在流速為1 mL/min條件下，觀察乙腈與水體積配比分別為 20∶80，15∶85，10∶90對(duì)棒曲霉素的分離效果。

在最優(yōu)體積比下或者各項(xiàng)體積比下，比較不同流速(1.0，0.8，0.6 mL/min)對(duì)棒曲霉素的分離效果[8]。

進(jìn)樣量:使用20μL的定量進(jìn)樣環(huán)滿環(huán)進(jìn)樣20μL。

(2)標(biāo)準(zhǔn)工作液的制備

取棒曲霉素對(duì)照品儲(chǔ)備液(1 mg/mL)，用醋酸-醋酸鈉緩沖液稀釋10倍得到濃度為100μg/mL的溶液，再用醋酸-醋酸鈉緩沖液逐級(jí)稀釋，得到濃度分別為25μg/mL、10μg/mL、5μg/mL、1μg/mL、0.25μg/mL、0.05μg/mL、0.01μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

(3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

在摸索出的色譜條件下滿環(huán)進(jìn)樣20 μL，每個(gè)濃度進(jìn)樣三次，記錄色譜峰保留時(shí)間、峰高和峰面積，取峰面積的平均值，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，使用Excel繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.3.2 金針菇的制備及檢測(cè)

金針菇的前處理

空白樣:分別稱取4份約170 g新鮮金針菇，放置在保鮮盒中，密封，分別于于第4天，第8天，第12天進(jìn)行棒曲霉素的提取。

青霉菌接種樣：分別稱取3份約170新鮮金針菇，密封，取現(xiàn)配的青霉菌混懸液，均勻噴灑在金針菇表面，分別于第4天、第8天，第12天進(jìn)行棒曲霉素的提取。

金針菇的提取分離及純化：將經(jīng)處理過(guò)后的金針菇使用組織搗碎機(jī)打成汁，用無(wú)紡濾布過(guò)濾，取50 mL金針菇汁，加入乙酸乙酯50 mL，分別萃取三次，每次振蕩3 min，棄去水相，合并有機(jī)相，用20 mL的1.5%碳酸鈉溶液快速洗滌有機(jī)相，洗滌時(shí)間控制在1 min以內(nèi)，靜置分層后，分離水相和有機(jī)相，水相再用少量乙酸乙酯洗滌一次，合并有機(jī)相。將有機(jī)相在38 ℃水浴上，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)至干，并立即用少量乙酸乙酯淋洗瓶壁3～4次，所得溶液在38～40 ℃水浴上揮去溶劑，再用醋酸-醋酸鈉緩沖液定容至3 mL，溶液經(jīng)樣品過(guò)濾器過(guò)濾后，得到供試品溶液。

青霉菌液體培養(yǎng)液處理樣：取上述青霉菌液體培養(yǎng)基得到的布滿菌絲塊的錐形瓶，用玻璃棒攪拌至菌絲塊散落，按上述金針菇汁處理方法，制作成供試品溶液。

金針菇樣品的檢測(cè)：在摸索出的色譜條件下，取各供試品溶液滿環(huán)進(jìn)樣20μL，每個(gè)濃度進(jìn)樣三次，記錄色譜峰保留時(shí)間、峰高，另進(jìn)一針棒曲霉素對(duì)照品溶液記錄保留時(shí)間和峰高，根據(jù)組分在色譜上的出峰時(shí)間與標(biāo)準(zhǔn)組分比較定性。每個(gè)供試品溶液進(jìn)樣三次，積分得到樣品棒曲霉素峰面積，取平均值，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算供試品中棒曲霉素濃度。

3 結(jié)果與分析

3.1 液相條件摸索結(jié)果

在1 mL/min流速下，取5μg/mL的棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液滿環(huán)進(jìn)樣，在乙腈∶水體積配比分別為20∶80，15∶85時(shí)的分離效果都比較好，在乙腈∶水體積配比10∶90時(shí)分離效果比較差，其中以乙腈∶水體積配比為15∶85時(shí)分離效果最好，因此確定流動(dòng)相為乙腈∶水(15∶85)。

在確定流動(dòng)相為乙腈∶水(15∶85)條件下，取5μg/mL的棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液滿環(huán)進(jìn)樣，在流速為1.0 mL/min時(shí)，各峰聚集在3～4 min內(nèi)，分離效果較差；在流速為0.8 mL/min時(shí)，各峰分離效果較好，對(duì)照品棒曲霉素出峰時(shí)間在7.5 min左右；在流速為0.6 mL/min時(shí)，各峰分離效果較好，各峰分離充分，但對(duì)照品出峰時(shí)間在9 min左右。因標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣10 min后，并無(wú)其他峰出現(xiàn)，擬定走樣時(shí)間為10 min，因此選取流速為0.8 mL/min作為檢測(cè)流速。

以1μg/mL濃度棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣，按高效液相色譜分析條件測(cè)定。

圖1 1μg/mL棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

3.2 方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果

3.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表1 標(biāo)準(zhǔn)品穩(wěn)定性結(jié)果

3.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表2 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.2.3 檢出限和定量限

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)工作液的高效液相圖譜數(shù)據(jù)分析，濃度為0.01μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液，在以基線平穩(wěn)的8～10 min為噪聲范圍，其信噪比為23.7，在檢出限和定量限信噪比定義限以上，故標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度范圍之間的樣品濃度均可定量檢測(cè)。

3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以標(biāo)準(zhǔn)品溶液為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，線性方程為y=112.89x-14.236，R2= 0.998 4。結(jié)果表明，棒曲霉素在0.01～25μg/mL濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.4 樣品檢測(cè)結(jié)果

圖3 空白樣4天高效液相色譜圖

圖4 青霉菌接種樣4天高效液相色譜圖

圖5 空白樣8天高效液相色譜圖

圖6 青霉菌接種樣8天高效液相色譜圖

圖7 空白樣12天高效液相色譜圖

圖8 青霉菌接種樣12天高效液相色譜圖

圖9 青霉菌液體培養(yǎng)液處理樣高效液相色譜圖

4 結(jié) 論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)定棒曲霉素的高效液相法的最佳色譜條件為：乙腈與水體積配比為15∶85；流速為0.8 mL/min。根據(jù)檢出限和重復(fù)性精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，高效液相法檢測(cè)棒曲霉素的靈敏度和精密度較高。用液液萃取法提取，碳酸鈉凈化制備的金針菇供試品，其高效液相譜圖雜峰較多，樣品凈化不充分，棒曲霉素峰面積不穩(wěn)定。經(jīng)檢測(cè)，青霉菌液體培養(yǎng)液處理樣中棒曲霉素的含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于其他樣品，有明顯可見(jiàn)的棒曲霉素峰，其保留時(shí)間與工作液中棒曲霉素的保留時(shí)間一致，故認(rèn)為青霉菌感染確會(huì)產(chǎn)生棒曲霉素。根據(jù)現(xiàn)有數(shù)據(jù)分析，金針菇供試品中，空白樣中棒曲霉素含量在前期要低于青霉菌接種樣，但在8天和12天，制備的金針菇樣品中，青霉菌接種樣中棒曲霉素的含量并未高于空白樣，可以認(rèn)為在8天及以后，棒曲霉素的生成已完成，含量不再增加?；蛘甙羟顾卦跇悠诽幚磉^(guò)程中有所損耗，檢測(cè)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于實(shí)際含量，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果的差異。

5 討 論

(1)在決定配制棒曲霉素溶劑方面，本實(shí)驗(yàn)曾存在很多疑慮。棒曲霉素具有易溶于水、乙醇、丙酮、乙酸乙醋和氯仿，耐酸，在堿性條件下不穩(wěn)定；在氯仿、苯、二氯甲烷等溶劑中能較長(zhǎng)時(shí)期穩(wěn)定，在水中和甲醇中逐漸分解，溶液蒸干后形成薄膜則不穩(wěn)定等性質(zhì)，但目前查閱到的很多文獻(xiàn)上，配制棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)液時(shí)使用的是甲醇。因不確定棒曲霉素在甲醇中能穩(wěn)定存在的時(shí)間，為了保險(xiǎn)起見(jiàn)排除用甲醇配液的方法。GB5009.185—2016上，在配制棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)溶液時(shí)，方法為使用乙腈配制棒曲霉素標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液，在-20 ℃下冷凍保存，有效期長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月；用儲(chǔ)備液制備標(biāo)準(zhǔn)工作液時(shí)，所用溶劑為4 ℃，有效期為3個(gè)月。因考慮到乙腈揮發(fā)性、棒曲霉素的性質(zhì)以及實(shí)驗(yàn)周期問(wèn)題，對(duì)照所查文獻(xiàn)其他樣品中棒曲霉素高效液相檢測(cè)法，本實(shí)驗(yàn)直接使用pH 3.6的醋酸-醋酸鈉緩沖液制備儲(chǔ)備液和標(biāo)準(zhǔn)工作液。在高效液相檢測(cè)法中，保持PH呈酸性可以避免棒曲霉素的降解。

(2)在比較金針菇空白樣和青霉菌接種樣放置4天和8天所得的譜圖時(shí)發(fā)現(xiàn)，放置8天的樣品譜圖中棒曲霉素的峰面積并沒(méi)有增加，且并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯的分解峰。考察實(shí)驗(yàn)過(guò)程，發(fā)現(xiàn)兩批次的樣品過(guò)程中，唯一存在較大差異的地方在于38～40 ℃水浴上揮去溶劑過(guò)程中，由于高效液相色譜儀使用無(wú)空缺，因此溶劑揮干后沒(méi)有立即配制成供試品溶液進(jìn)行檢測(cè)，我們猜測(cè)可能是：①由于棒曲霉素在干燥條件下不穩(wěn)定，易降解；②由于棒曲霉素在生成的環(huán)境中，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)有可能含量下降，就像植物中某一成分，在某一時(shí)間含量達(dá)到最高，以后隨著時(shí)間的延長(zhǎng)含量在下降。③實(shí)驗(yàn)所采取的提取凈化方法效率太低，導(dǎo)致供試品中雜質(zhì)太多，成分堆積，造成成分分離困難，各峰聚集，造成保留時(shí)間延后或者聚集成寬峰，并入其他峰的結(jié)果。

參考文獻(xiàn)：

[1] 畢志樹(shù),鄭國(guó)揚(yáng),李泰輝. 廣東大型真菌志[M]. 廣州：廣東科技出版社，1994.

[2] 刁治民,劉禹宏,田玉華. 青海藥用蕈菌[M]. 西寧：青海人民出版社，1994.

[3] 夏紅民,岳寧,張鵬.出入境農(nóng)產(chǎn)品安全衛(wèi)生檢驗(yàn)的重要對(duì)象—真菌毒素檢驗(yàn)[J].檢疫科學(xué),2000(5):56-59.

[4] 蔣雄圖,虞左向．棒曲霉素[J]．無(wú)錫輕工業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào)，1989，8 (2)：73-84．

[5] 朱從會(huì)．?dāng)U展青霉拮抗放線菌的分離、鑒定及其液體培養(yǎng)研究[D]．楊凌：西北農(nóng)林科技大學(xué)，2008：1-2．

[6] ABDORREZA M, ROUYA T, MARZIEH K, et a1．Enzyme-assisted extraction and ionic liquid-based dispersive liquid-liquid microextraction followed by high-performance liquid chromatography for determination of patulin in apple juice and method optimization using central composite design [J]．Analytica Chimica Acta,2013，804：104-110．

[7] GOKMEN V，ACAR J，SARIOGLU K．Liquid chromatographic method for the determination of patulin in apple juice using solid-phase extraction[J]．Analytica Chimica Acta，2005，543：64-69.

[8] CHO M S，KIM K，SEO E，et a1．Occurrence of patulin in various fruit juices from South Korea：an exposure assessment[J]．Food Sei Biotechnol，2010，19(1)：1-5.