銀耳多糖最適提取工藝條件探析

孫晨雨，王 飛，張建玲，李長婷，閆 楊，欒仙德，孟 超

（泰山醫(yī)學院，山東泰安 271000）

銀耳多糖 （Tremella polysaccharides，TP） 是銀耳中一種重要的生物活性物質(zhì)，能夠提高機體的免疫能力，并誘導干擾素的產(chǎn)生，經(jīng)常食用銀耳對預(yù)防癌癥等多種疾病具有非常顯著的效果。銀耳多糖在不同程度上對細胞因子IL-1α，IL-6，IL-8的產(chǎn)生起到促進作用，且呈劑量依賴性[1]。銀耳多糖具有誘導單核細胞產(chǎn)生白介素IL-1，IL-6和腫瘤壞死因子的作用，而且多糖降解產(chǎn)物具有誘導單核細胞分泌IL-1或IL-6的作用，所以銀耳多糖對細胞因子的作用可能是通過各水解片段所共有的結(jié)構(gòu)實現(xiàn)的。銀耳多糖通過對IL-2，IL-6和TNF-α的mRNA表達來促進這些細胞因子的生成[2]。

銀耳多糖是一種免疫增強劑，可以通過激活免疫細胞來提高機體的免疫功能。根據(jù)聶偉等人[3]的研究可知，銀耳多糖能夠有效地激活淋巴細胞，提高淋巴細胞轉(zhuǎn)化為T淋巴細胞和B淋巴細胞的數(shù)量，增強淋巴細胞抵抗腫瘤細胞的能力，并且在服用多糖的期間機體的主要臟器不會受到一般藥物副作用的損傷。尤其針對體內(nèi)白細胞減少的癥狀，Guo F C等人[4]通過對小鼠進行抑制淋巴瘤試驗發(fā)現(xiàn)，銀耳多糖對小鼠外周白細胞減少的癥狀有明顯的提高白細胞數(shù)量的作用。根據(jù)李璐等人[5]的試驗研究可以得知，銀耳多糖對小鼠淋巴瘤有較高的抑制作用，抑制率大約為60%，結(jié)合γ射線，能夠有效治療在腫瘤的放療和化療過程中所造成的白細胞減少的癥狀。

根據(jù)銀耳原料的不同，銀耳多糖常用的提取方法有熱水浸提法、堿浸提法、酶法提取法和超聲波輔助提取法等4種。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

福建古田銀耳子實體干品，購買量為120g（置于陰涼干燥處，避免陽光直射）。

1.1.2 復合酶液的制備

精密稱取500 U/mg果膠酶0.5 g，10 U/mg纖維素酶1.5 g，100 U/mg中性蛋白酶 2.0 g，并置于100 mL的容量瓶中，加蒸餾水至100 mL刻度線處。搖勻后于50℃下水浴1 h，置于4℃下存放。所使用的果膠酶、纖維素酶和中性蛋白酶，均由濟南雨同生物科技有限公司提供。

1.1.3 Sevage試劑

氯仿和正丁醇的配比按照5∶1的比例精確量取，置于玻璃瓶中存放，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.1.4 其他藥品及試劑

蒽酮/Anthrone，5 g（S19210），純度在 95%～99%的正丁醇，于室溫下避光保存；98%濃硫酸，避光密封保存；純度為99.8%的三氯甲烷，密封遮光，置于陰涼通風處保存。

1.1.5 試驗儀器

FZ102型高速粉碎機，天津市泰斯特儀器有限公司產(chǎn)品；LQ-A005型電子天平，瑞安市安特稱重設(shè)備有限公司產(chǎn)品；HH.W21-600型恒溫水浴鍋，北京中興偉業(yè)儀器有限公司產(chǎn)品；722型可見分光光度計，上海恒平科學器有限公司產(chǎn)品；燒杯、錐形瓶、容量瓶、研砵、10 mL具塞試管、比色皿等。

1.2 試驗方法

1.2.1 銀耳子實體的處理步驟

（1）稱量、研磨。精確稱取無雜質(zhì)銀耳子實體干品2.000 g 2份。其中，1份先按料液比1∶80加水，在室溫下（20～25℃） 浸泡30 min，再置于小型研缽中充分搗碎，制成銀耳漿液；另1份先在高速研磨機中粉碎2 min，再按料液比1∶80加水在室溫下浸泡30 min，制成銀耳漿液。

（2） 加酶。采用復合酶浸提法[6]，調(diào)pH值至6.3，加入復合酶1.5%，于50℃條件下反應(yīng)40 min，迅速升溫至80℃滅酶，并在50，60，70，80，90℃下恒溫浸提1.0，1.5 h。

（3） 離心。以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心5 min，取離心后銀耳浸提液4 mL，與Sevage試劑以5∶1的比例加入各離心管中，搖勻。以轉(zhuǎn)速4 000 r/min離心10 min，除雜蛋白。

（4）測吸光度度。取2 mL的浸提液置于相應(yīng)的具塞試管中，每個具塞試管加入6 mL的硫酸蒽酮試液，沸水浴10 min，然后冷水浴15 min，作一空白對照（2 mL的蒸餾水加入6 mL的硫酸蒽酮試液）。用分光光度計在波長620 nm處測量其吸光度；記錄18支樣品溶液的吸光度值，繪出相應(yīng)的折線圖。

1.2.2 硫酸蒽酮法測定多糖含量標準曲線的繪制

（1） 對照品溶液的制備。無水葡萄糖對照品10mg，置于100 mL容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得0.1 mg/mL的葡萄糖標準液。

（2） 蒽酮試液的制備。取蒽酮0.20 g，加入100 mL濃硫酸溶解即得蒽酮試液，現(xiàn)配現(xiàn)用，置于棕色瓶中4℃放置。

（3）標準曲線的制備。精密量取對照品溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL，分別加入蒸餾水至2.0 mL。分別精密量取6.0 mL的蒽酮試液，搖勻后冷卻15 min。沸水浴10 min后，冷水冷卻15 min，測定波長620 nm處吸光度值。以葡萄糖的質(zhì)量濃度為橫坐標，以吸光度為縱坐標，繪制標準曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

根據(jù)不同質(zhì)量濃度葡萄糖溶液下測得的銀耳多糖吸光度所繪制的標準曲線。

不同質(zhì)量濃度葡萄糖溶液下銀耳多糖吸光度標準曲線見圖1。

圖1 不同質(zhì)量濃度葡萄糖溶液下銀耳多糖吸光度標準曲線

2.2 不同條件下銀耳浸提液中銀耳多糖吸光度測定的試驗結(jié)果

浸泡前成粉碎狀態(tài)的銀耳于溫度分別為50，60，70，80℃的條件下，浸提1 h后，銀耳多糖溶液在波長620 nm處的吸光度分別為0.463，0.657，0.546，0.520；浸提1.5 h后，銀耳多糖溶液在波長620 nm處的吸光度分別為0.447，0.629，0.521，0.517。

浸泡后，將再研磨的銀耳于溫度分別為50，60，70，80，90℃的條件下，浸提1 h后，銀耳多糖溶液在波長620 nm處的吸光度分別為0.490，0.501，0.512，0.539，0.520；浸提1.5 h后，銀耳多糖溶液在波長620 nm處的吸光度分別為0.432，0.503，0.563，0.604，0.591。

2.3 銀耳多糖提取率的計算

根據(jù)朗伯-比爾定律表示：A=lg（1/T）=Kbc.式中：A——吸光度；

T——透射比；

K——摩爾吸收系數(shù)；

c——吸光物質(zhì)的質(zhì)量濃度；

b——吸收層厚度，為1 cm。

根據(jù)朗伯-比爾定律求得不同條件下銀耳浸提液中銀耳多糖的質(zhì)量濃度。

不同浸提溫度下粉碎狀態(tài)的銀耳多糖質(zhì)量濃度見圖2，不同溫度下浸泡后研磨的銀耳多糖質(zhì)量濃度見圖3。

圖2 不同浸提溫度下粉碎狀態(tài)的銀耳多糖質(zhì)量濃度

圖3 不同溫度下浸泡后研磨的銀耳多糖質(zhì)量濃度

3 結(jié)果分析與討論

3.1 銀耳浸提條件的選擇

銀耳與蒸餾水以1∶80的比例在室溫下浸泡30 min，加入復合酶1.5%，于50℃條件下酶促反應(yīng)40 min，之后在設(shè)定溫度下浸提1.0，1.5 h。

3.2 銀耳多糖提取工藝的優(yōu)化

根據(jù)圖2可知，銀耳在浸泡后呈粉碎狀態(tài)時浸提1 h，在50～60℃條件下浸提，銀耳多糖的質(zhì)量濃度不斷增加，從0.141 mg/mL增加到0.199 mg/mL。在60℃之后，隨著浸提溫度的增加，銀耳多糖的質(zhì)量濃度隨之下降，銀耳多糖的最低質(zhì)量濃度在80℃時為0.157 8 mg/mL。銀耳在浸泡前呈粉碎狀態(tài)時浸提1.5 h，也是在60℃下浸泡1.5 h的效率最高，得到的銀耳多糖質(zhì)量濃度最高為0.191 mg/mL。所以，在相應(yīng)的溫度下浸提1.5 h后所得到的銀耳多糖質(zhì)量濃度比浸提1 h所得到的銀耳多糖質(zhì)量濃度要低，雖然相差不大，但是考慮到效率和成本的問題，可以選擇在60℃下浸提1 h提取銀耳多糖。

根據(jù)圖3可知，銀耳在浸泡后呈粉碎狀態(tài)時浸提1 h，在80℃的提取效率最高，為0.164 mg/mL。在50～80℃條件下浸提，銀耳多糖質(zhì)量濃度不斷增加，從0.149 mg/mL增加到0.164 mg/mL。在80℃以后，銀耳多糖質(zhì)量濃度不斷減少。銀耳在浸泡后呈粉碎狀態(tài)時浸提1.5 h，是在80℃條件下浸泡1.5 h的效率最高，為0.183 mg/mL。

綜上所述，銀耳的不同狀態(tài)在不同溫度和不同浸提時間下浸提，并根據(jù)計算得到的銀耳多糖質(zhì)量濃度綜合比較得知，其在浸泡前呈粉碎狀態(tài)下以料液比1∶80的加水比浸泡，于60℃條件下浸提1 h所得到的銀耳多糖質(zhì)量濃度最高，銀耳多糖的浸提率也最高。

3.3 影響試驗的主要因素

在浸泡前被粉碎，結(jié)構(gòu)被破壞，復合酶容易發(fā)生作用，使銀耳子實層、單子層和擔孢子的表面及連接物充分分解，當酶促反應(yīng)達到一定程度（最適酶促反應(yīng)時間為40 min），熱水浸提溫度是影響浸提率的關(guān)鍵。通過提高溫度，起到了滅酶作用，又使得可溶于熱水的胞內(nèi)多糖溶出率增加。

3.4 銀耳多糖提取工藝的細化

若是沒有任何試驗依據(jù)的情況下，可以采用單因素變量試驗。根據(jù)單因素試驗的結(jié)果縮小每個提取條件的范圍，再根據(jù)縮小后的范圍進行多因素多水平的正交試驗。

參考文獻：

[1]Xia Dong，Lin Z B.Effets of Tremella polysaccha-rides on immune function in mice[J].Acta Pharm Sinica，1989，10（5）：453-456.

[2]Chen B.Optimization of extraction of Tremella fuciformis polysaccha-rides and its antioxidant and antitumour activities in vitro[J].Carbohydr Polymer，2010 （7）：420-424.

[3]聶偉，張永祥，周金黃.銀耳多糖的藥理學研究概況 [J].中藥藥理與臨床，2000，16（4）：44-46.

[4]Guo F C，Kwakkel R P，Williams B A，et al.Effects of mushroom and herb polysaccharides on cellular and humoral immune responses of Eimefia tenella-infected chickens[J] ．Pourlt Sci.，2004 （3）：1 124-1 132.

[5]李璐，畢富勇，呂俊.銀耳多糖誘導肝癌HepG-2細胞凋亡的研究 [J].實用醫(yī)學雜志，2009，25（7）：1 033-1 035．

[6]侯建明，陳剛，藍進.銀耳多糖對脂類代謝影響的實驗報告 [J].中國療養(yǎng)醫(yī)學，2008，17（4）：234-236．◇